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家蚕(Bombyx mori)是重要而独特的经济昆虫,至今已被人类驯化利用长达5000余年。作为对人类贡献最大的鳞翅目昆虫,家蚕的转基因研究一直倍受关注。目前,国内外已有研究机构利用鳞翅目昆虫来源的piggyBac转座子建立起了家蚕转基因技术平台。随着家蚕基因组框架图和精细图的相继完成,国内外的主要研究力量迅速集中到了利用转基因等技术研究基因功能和开发生物反应器等应用领域。家蚕以其绢丝腺独特、高效的蛋白质合成与分泌能力而称著,加之其具有大规模生产成本低和对人畜安全等优点,是新一代生物反应器的理想模型,有巨大的开发潜力。近年来,家蚕生物反应器制药技术、丝蛋白生物材料开发等技术体系已逐步进入实用化研究阶段。本文拟通过构建基于piggyBac的中部丝腺特异表达载体,以滞育性蚕品系大造作为转基因受体材料,筛选获得具有外源蛋白表达活性的转基因品系。本研究的内容与结果如下:1.人干扰素-ω基因的克隆及序列分析从NCBI网站上下载人干扰素-ω基因(huIFN-ω)序列,利用Oligo软件对其开放阅读框(ORF)进行预测,并在ORF两端设计引物,引物上下游5’端均引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,在下游引物序列中添加组氨酸标签用于目的蛋白的纯化。以健康人血液基因组为模板,扩增获得了大小为776 bp的片段,将扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体,经测序验证,扩增序列与预测序列一致。序列分析表明,huIFN-ω为单外显子,mRNA全长1514 bp,1～575为5’UTR,1164～1514为3’UTR,CDS为576～1163,576～644为碱基编码信号肽,成熟蛋白的编码区域为645～1163,在第58～175个氨基酸之间含有IFabd结构域。预测其蛋白分子量为23.4 kD,等电点为9.18。2.基于piggyBac转座元件的家蚕中部丝腺特异表达载体的构建以来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的piggyBac转座子元件为基础载体,家蚕中部丝腺特异表达基因Serl的上游调控序列为启动子,以在眼睛和神经特异表达的增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为报告基因,从pMD19-TSimple载体切下目的基因huIFN-ω后克隆到pSL[ser1-MCS-SV40]载体,然后将ser1-huIFN-ω-SV40片段切下,连接到pBac[3xp3-EGFPafm]表达载体,构建成家蚕中部丝腺特异表达载体pBac[ser1-huIFN-ω,3xp3-EGFP]。经酶切和测序鉴定,载体构建正确,可用于下一步的转基因注射。3.表达人干扰素-ω蛋白的家蚕转基因个体的筛选以本实验室保存的蚕种系大造(P50)作为转基因受体材料,将构建好的表达载体高纯质粒和辅助质粒按1:1的摩尔比混合至终浓度400 ne/ul,显微注射进产后1-3h的大造早期胚胎(记为G0代),每粒蚕卵10～15nl。至G0代蛾产卵后5-7d置于体视荧光显微镜下检测,筛选获得在眼睛和神经组织发绿色荧光的转基因阳性个体(记为G1代)。4.转基因阳性个体的分子检测随机选取G1代转基因蚕蛾,提取基因组DNA后分别对插入拷贝数情况进行检测。结果表明,huIFN-ω基因成功整合到阳性个体基因组中,并且,3个阳性个体中均插入了2个拷贝,即发生了两次转座事件。RT-PCR检测结果表明,huIFN-ω基因在家蚕中部丝腺高量转录表达。5.重组蛋白huIFN-ω的活性检测取50头发育至五龄6天的G2代转基因阳性个体的中部丝腺提取重组蛋白,经超滤浓缩后进行Western blot检测。结果表明,huIFN-ω蛋白在家蚕中部丝腺中特异表达。进一步采用MTT法进行活性鉴定发现,重组蛋白huIFN-ω提取液对人肝癌细胞hepG2的抑制率为29.3%,表明,家蚕中部丝腺特异表达的重组蛋白huIFN-ω具有一定的抗细胞增殖活性。