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目的
探讨右归丸对肾阳虚证患者固有免疫受体TLRs表达的影响,为临床治疗肾阳虚证及右归丸的干预作用机制提供科学研究依据。
方法
1.根据肾阳虚证诊断评分量表与2位中医内科专家确诊的方法,筛选肾阳虚证患者14例作为研究对象,予以右归丸煎剂口服2月治疗,治疗前后分别抽取静脉血5ml留样,以备提取白细胞总RNA。
2.使用人TLRs信号通路PCR芯片检测。芯片内含84个与TLRs通路信号传导的相关基因,每份样本与1个芯片进行杂交,同时收集荧光,据熔解曲线和扩增曲线计算所有PCR芯片中的每个基因的Ct值。
3.使用ΔCt法计算各组RNA在TLRs信号通路基因的表达量:计算各组中每个杂交芯片TLRs通路相关基因的ΔCt值,方法为:ΔCt=Ct(实验组)-Ct(内参基因);再通过2-ΔCt算法计算各组中所对应基因的表达差异。
4.运用Prismpad8.0软件对靶基因统计学数据、Pathway与ROC曲线三个方面进行分析,整理出TLRs的诊断与干预功能,筛查肾阳虚证相关的调控通路,分析右归丸煎剂对肾阳虚证的调控作用。
结果
1.依据Studenttest验证组间差异,以P<0.05为有统计学意义验证差异,在与健康对照组的比较过程中,发现肾阳虚证组患者外周血白细胞TLRs信号通路中有28个基因表达出现差异,其中24个下调,4个上调。出现表达差异的28个基因中,有9个TLRs家族基因,且除了TLR9上调外,其余均为下调。
2.肾阳虚证组与治疗组比较发现,外周血白细胞TLRs信号通路中共有38个基因出现表达差异(P<0.05),其中30个下调,8个上调。
3.治疗组与健康对照组进行对比后获得了10个共同差异表达基因,其中8个在肾阳虚证干预前下调的基因经右归丸煎剂干预后其表达水平上调,2个在肾阳虚证治前上调的基因表达水平下调,其余8个基因经右归丸煎剂干预后,其表达水平与健康对照组比较差异无统计学意义。
结论
1.筛选出右归丸煎剂通过TLRs通路干预肾阳虚证的相关基因:TLR1、CD14、LY86、TOLLIP、CLEC4E、TLR8、MYD88、HARS、LY96、JUN。
2.本试验表明在肾阳虚证与TLRs的相关基因表达存在相关性,右归丸煎剂对TLR1、CD14、LY86、TOLLIP、CLEC4E、TLR8、MYD88、HARS、LY96、JUN,有一定调控作用,其靶基因不仅作用于自身信号通路还会对其他信号通路的调控有所影响。
3.虚证的形成与TLRs所介导的免疫反应过程紧密相关,TLRs所介导的MYD88、NF-κB、MAPKs等信号通路广泛参与了中医虚证的相关疾病,其通路调控炎症基因的转录、翻译和表达激活一系列炎症产物,这些产物既能直接损伤细胞,破坏细胞外基质,又做为内源性配体与中性粒细胞、NK细胞等表面的相应受体结合,进一步合成并释放大量炎症介质并募集炎症细胞,形成一个正反馈循环,使炎症反应级联放大。
探讨右归丸对肾阳虚证患者固有免疫受体TLRs表达的影响,为临床治疗肾阳虚证及右归丸的干预作用机制提供科学研究依据。
方法
1.根据肾阳虚证诊断评分量表与2位中医内科专家确诊的方法,筛选肾阳虚证患者14例作为研究对象,予以右归丸煎剂口服2月治疗,治疗前后分别抽取静脉血5ml留样,以备提取白细胞总RNA。
2.使用人TLRs信号通路PCR芯片检测。芯片内含84个与TLRs通路信号传导的相关基因,每份样本与1个芯片进行杂交,同时收集荧光,据熔解曲线和扩增曲线计算所有PCR芯片中的每个基因的Ct值。
3.使用ΔCt法计算各组RNA在TLRs信号通路基因的表达量:计算各组中每个杂交芯片TLRs通路相关基因的ΔCt值,方法为:ΔCt=Ct(实验组)-Ct(内参基因);再通过2-ΔCt算法计算各组中所对应基因的表达差异。
4.运用Prismpad8.0软件对靶基因统计学数据、Pathway与ROC曲线三个方面进行分析,整理出TLRs的诊断与干预功能,筛查肾阳虚证相关的调控通路,分析右归丸煎剂对肾阳虚证的调控作用。
结果
1.依据Studenttest验证组间差异,以P<0.05为有统计学意义验证差异,在与健康对照组的比较过程中,发现肾阳虚证组患者外周血白细胞TLRs信号通路中有28个基因表达出现差异,其中24个下调,4个上调。出现表达差异的28个基因中,有9个TLRs家族基因,且除了TLR9上调外,其余均为下调。
2.肾阳虚证组与治疗组比较发现,外周血白细胞TLRs信号通路中共有38个基因出现表达差异(P<0.05),其中30个下调,8个上调。
3.治疗组与健康对照组进行对比后获得了10个共同差异表达基因,其中8个在肾阳虚证干预前下调的基因经右归丸煎剂干预后其表达水平上调,2个在肾阳虚证治前上调的基因表达水平下调,其余8个基因经右归丸煎剂干预后,其表达水平与健康对照组比较差异无统计学意义。
结论
1.筛选出右归丸煎剂通过TLRs通路干预肾阳虚证的相关基因:TLR1、CD14、LY86、TOLLIP、CLEC4E、TLR8、MYD88、HARS、LY96、JUN。
2.本试验表明在肾阳虚证与TLRs的相关基因表达存在相关性,右归丸煎剂对TLR1、CD14、LY86、TOLLIP、CLEC4E、TLR8、MYD88、HARS、LY96、JUN,有一定调控作用,其靶基因不仅作用于自身信号通路还会对其他信号通路的调控有所影响。
3.虚证的形成与TLRs所介导的免疫反应过程紧密相关,TLRs所介导的MYD88、NF-κB、MAPKs等信号通路广泛参与了中医虚证的相关疾病,其通路调控炎症基因的转录、翻译和表达激活一系列炎症产物,这些产物既能直接损伤细胞,破坏细胞外基质,又做为内源性配体与中性粒细胞、NK细胞等表面的相应受体结合,进一步合成并释放大量炎症介质并募集炎症细胞,形成一个正反馈循环,使炎症反应级联放大。