胰腺癌是一种极具侵袭性的癌症类型,是因癌症死亡的主要原因之一,世界范围内仅2000年就有超过200,000人死于此疾病。胰腺癌有其特征性的基因类型,常发生K-ras、p53、p16INK4α及Smad 4的基因突变。胰腺癌的高致死率是因其对化疗和放射治疗不敏感,因此需要研究与探索新的治疗方法。免疫监督抑制肿瘤发生时,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)正常表达于自然杀伤细胞,因此是一种天然的肿瘤杀伤因子。已有许多证据表明,可将TRAIL用于人类胰腺癌的治疗：①胰腺癌细胞表面表达TRAIL死亡受体DR4、DR5;②重组可溶性TRAIL可诱导胰腺癌细胞发生凋亡；③给胰腺癌移植瘤小鼠注射表达TRAIL的腺病毒载体可抑制肿瘤生长；④TRAIL联合用药可抑制胰腺癌病人的肿瘤生长。然而大多数胰腺癌细胞却对TRAIL诱导凋亡的作用并不敏感,其原因就是胰腺癌细胞存在抵抗TRAIL介导凋亡的机制。 信号通路中TRAIL诱导的凋亡由多水平调节,故TRAIL在进入胰腺癌临床试验前需阐明其抵抗机制。蛋白质组学基础上的研究方法可以定量研究复杂的细胞蛋白质图谱变化以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用,可监控不同生理条件下的分子变化过程。本论文采用细胞与分子生物学和蛋白组学方法研究差异表达蛋白,并进一步通过免疫共沉淀分析差异蛋白的相互作用及其在p53蛋白功能调节中的作用。我们的研究结果首次阐明HSP27与HSPA8可通过与p53蛋白相互作用来调节TRAIL诱导的凋亡,揭示了一种新的胰腺癌细胞耐药机制。 第一部分 TRAIL对胰腺癌细胞诱导的凋亡作用以及胰腺癌细胞TRAIL受体的表达 采用MTT法测定TRAIL对胰腺癌细胞株SW1990和PANC1的增殖抑制,通过倍比梯度稀释,计算两种细胞在不同药物浓度作用下的增殖抑制率,以此来鉴定肿瘤细胞株对TRAIL的敏感性。通过AnnexinV-FITC双染法研究TRAIL处理后两种胰腺癌细胞株的凋亡发生率。通过逆转录PCR法(RT-PCR)分析2种细胞株中TRAIL受体(DR4,DR5,DcR1及DcR2)在mRNA水平的表达情况,了解受体表达量的高低是否与其对药物的敏感性相关。研究结果发现:TRAIL,对SW1990细胞有明显的增殖抑制作用(IC50=0.074μg/ml),且该作用呈剂量依赖性,而对PANC1细胞的作用则不明显(IC50=0.65μg/ml);在相同的药物浓度下,流式细胞检测两种细胞的凋亡率有显著的差异,该结果与细胞增殖抑制试验相一致,证明TRAIL以诱导凋亡的方式使细胞死亡；RT-PCR显示,TRAIL受体mRNA的表达与其敏感性无直接关联,提示胰腺癌细胞对于TRAIL的抵抗更依赖于胞内机制的调节。 第二部分蛋白组学技术研究TRAIL诱导前后细胞差异表达蛋白 依照文献,采用循环反复冻融法提取细胞总蛋白,Bradford法蛋白定量。双向电泳分离药物作用前后细胞总蛋白,获得分辨率高、重复性好的双向电泳谱图谱。敏感株SW1990与耐药株PANC1的pH 3-10的图谱显示平均蛋白点分别为620±15和550±23。PDQuest 7.4软件图像分析比对,以两倍差异为阈值得到差异蛋白点58个,质谱成功鉴定38个。功能预测显示与细胞凋亡、细胞分化、蛋白质折叠、蛋白质氧化还原、分子伴侣等相关。两种细胞存在8个共同差异蛋白,值得关注的是HSP27和HSPA8,它们在两种细胞中的差异截然相反,如SW1990表现为游离态的HSP27低表达,而游离态的HSPA8高表达；PANC1呈完全相反的现象。推测两者可能参与TRAIL诱导细胞凋亡的调节过程,具体机制尚需进一步研究。 第三部分质谱结果验证及差异蛋白相互作用的功能研究 采用western-blot在蛋白水平、半定量RT-PCR在mRNA水平进行质谱结果的验证。结果显示HSP27和HSPA8在敏感株和耐药株中的表达差异与双向电泳结果一致,证明质谱结果可信。借助信号转导研究工具PathwayAssist 3.08建立了生物分子相互作用关系网络,研究发现HSP27、HSPA8可分别与p53蛋白结合并发生相互作用,进而调节p53下游相关基因(BAX/Bcl-2、FAS/APO1及IGF-BP3等)的表达,从而调控细胞凋亡过程。该部分利用免疫共沉淀(IP)实验研究发现,p53可同时与HSP27和HSPA8结合形成三重复合物,且药物诱导后两种蛋白与p53的亲和力发生改变,SW1990表现为HSP27与p53的亲和力增加,而HSPA8与之的亲和力下降；PANC1呈完全相反的现象。该结果揭示,在TRAIL诱导的凋亡中,HSP27可能为一种正性调控因子,而HSPA8可能为一种负性调控因子,两者造成了不同胰腺癌细胞株对TRAIL的敏感性差异。但其具体的调控机理有待进一步的研究。