应激可以引起机体产生一系列复杂的生理和心理反应。过于强烈或持久的应激反应往往导致认知功能障碍、情绪行为改变等,甚至诱发焦虑症、抑郁症和创伤后应激障碍等严重的神经精神问题。有大量研究表明内源性阿片系统在学习记忆过程中有着重要的调控作用。同时应激反应产生的内源性阿片肽和糖皮质激素之间存在密切关系。但内源性阿片系统是否参与急性应激引起的学习记忆的损伤,其机制目前尚不明确。本实验室前期研究利用Morris水迷宫实验发现高台应激50 min损伤小鼠空间参考记忆的提取,且阻断μ阿片受体可以反转高台应激引起的空间参考记忆提取的损伤效应。以上行为学结果提示μ阿片受体系统可能参与调控急性应激引起的小鼠空间参考记忆提取,但是在急性应激过程中μ阿片受体及其配体的变化并不清楚。本课题通过分子生物学方法观察急性应激引起的μ阿片受体和配体的变化,并在此基础上构建GABA能神经元、星形胶质细胞和谷氨酸能神经元上μ阿片受体的条件特异性基因敲除鼠,为进一步研究μ阿片受体介导急性应激后记忆损伤的具体途径提供技术基础。结果分为两部分:第一部分:μ阿片受体和内源性阿片肽在急性应激中的变化(1)ELISA检测高台应激50min后小鼠海马脑啡肽含量显著升高,说明急性应激通过增强脑啡肽释放而引发记忆损伤。(2)Western Blot检测高台应激后小鼠海马μ阿片受体磷酸化水平和细胞膜上μ阿片受体的表达量,结果显示急性应激引起μ阿片受体的磷酸化水平显著升高,应激25 min细胞膜上μ阿片受体无明显变化,应激50 min细胞膜上μ阿片受体显著减少,说明急性应激激活μ阿片受体。(3)高台应激50min小鼠血清皮质酮含量显著升高,μ阿片受体拮抗剂预处理并不影响高台应激导致的皮质酮的释放增高,说明μ阿片受体活化介导的空间参考记忆的损伤效应独立于皮质酮及其受体介导的途径。第二部分:细胞特异μ阿片受体基因条件性敲除鼠的构建和鉴定(1)利用Cre/Loxp基因重组系统对特定基因进行组织特异性删除。本研究利用此原理构建细胞特异μ阿片受体基因条件性敲除鼠,PCR选择条件性敲除鼠的全敲鼠和对照鼠。(2)Western Blot检测GABA能神经元μ阿片受体基因特异性敲除鼠海马和纹状体的μ阿片受体的表达情况,结果显示μRGABA-/-海马和纹状体μ阿片受体表达减少。检测星形胶质细胞μ阿片受体基因特异性敲除鼠海马的μ阿片受体的表达情况,结果显示μRAstro-/-海马μ阿片受体表达减少。检测谷氨酸能神经元μ阿片受体基因特异性敲除鼠海马的μ阿片受体的表达情况,结果显示μRGlut-/-海马μ阿片受体表达无明显变化。(3)免疫荧光多重标记检测μRGABA-/-和μRAstro-/-基因鼠海马μ阿片受体的表达。综合以上结果GABA能神经元和星形胶质细胞μ阿片受体基因条件特异性敲除鼠构建成功。