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泰乐菌素是由放线菌属弗氏链霉菌经发酵提取而得到的一种大环内酯类动物专用抗生素。在实际生产中普遍存在泰乐菌素用量过大、用药时间过长、滥用药物以及不遵守休药期提前屠宰等现象,已普遍引起较严重的泰乐菌素残留的发生。目前世界上大多数国家已经制定了动物源食品中泰乐菌素的残留限量,确保消费者的食用安全。本研究目的是制备针对泰乐菌素特异性单克隆抗体,建立间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)检测泰乐菌素的残留。
本文将泰乐菌素和牛血清蛋白(BSA)进行偶联,通过紫外分光光度计确定偶联成功,将此偶联物泰乐菌素-BSA作为免疫抗原,免疫8周龄BALB/c小鼠,每次免疫间隔14天,免疫4次,最后一次免疫3天后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。同时泰乐菌素和鸡卵清白蛋白(OVA)进行偶联,以偶联物泰乐菌素-OVA作为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出阳性细胞,获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单克隆抗体经签定为IgG免疫球蛋白,腹水的间接ELISA效价从分别为8×103。该淋巴杂交瘤细胞经体外培养、传代、冻存和复苏后抗体性质稳定。特异性鉴定结果表明,与替米考星(TIL)的交叉反应为27％,与其它大环内脂类抗生素无交叉反应。
对ELISA各检测条件进行了优化,获得了最佳的反应条件。用方阵滴淀法确定包被抗原的浓度为8ug/mL,单抗的最适合稀释倍数为1:8000。Logit/Log拟合标准曲线为y=1.84x+2.02,相关系数r=0.9944,线性检测范围为1.5～121.5ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为10.3ng/mL,灵敏度为1.5ng/mL,检测限为1.5～3.0ng/mL;肌肉、肝脏、蜂蜜的添加回收率分别为64%-99%、61%-102%和60.5%-95%;平均批内和批间变异系数均小于10%。泰乐菌素试剂盒在4～C可保存6个月以上。本文建立的竞争ELISA检测试剂盒可用于动物源性食品中泰乐菌素残留的快速初筛定量检测。