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猪附红细胞体病是由附红细胞体寄生于猪红细胞表面、血浆及骨髓，引起不明原因的发热、黄疸、贫血等症状的一种人兽共患传染病。由于动物感染附红细胞体带来的危害日益严重，受到了各国的普遍关注，尤其在近几年给我国的畜牧养殖业造成重大损失。目前，该病没有标准的免疫控制方法和特效治疗药物，所因此，建立一种适合于临床快速诊断出该病的检测方法，减少该病对人畜的健康危害，对该病的控制及预防都具有重要意义。
本研究依据GenBank发布的猪附红细胞体Eno基因序列，设计合成一对特异性引物，在引物的上下游5’端分别标记上生物素(BIOT)和地高辛(DIG),扩增获得PCR产物。按照PCR-ELISA方法操作，通过优化包被液种类、包被液浓度、结合抗体的反应条件、封闭条件、PCR产物稀释度及显色时间等，确定最优条件。通过检测的30份阴性样本的OD值计算本研究建立的PCR-ELISA方法的临界值。通过检测猪附红细胞体基因组DNA梯度稀释的OD值，测定该方法敏感性。通过扩增猪附红细胞体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫及健康猪血基因DNA片段，检测所建立PCE-ELISA方法的特异性。通过对同一批次、不同批次包被酶标板的重复性试验来检测该PCR-ELISA方法的稳定性。应用所建立的PCR-ELISA方法对延边地区猪场40份猪血液样品检测，并与夏晓辉建立的PCR-ELISA方法比较。
结果表明，常规PCR扩增出大小约为170bp，与预期结果相一致。PCR-ELISA优化结果确定了:包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液、链酶亲和素浓度选择5μg/mL、酶标二抗选择1∶2000、3％ BSA封闭液、2 mg/mL鲑鱼精DNA、封闭时间为60 min、PCR产物稀释30倍以及底物显色15 min等最佳反应条件。确定了本研究建立的PCR-ELISA方法的临界值为0.192。能检测出猪附红细胞体基因组DNA的最低浓度为0.33pg，敏感性较传统PCR方法高10倍。PCR方法与建立的PCR-ELISA方法未检测到猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫等基因组DNA扩增后的PCR产物，表明该方法具有很好的特异性。批内重复性试验与批间重复性试验结果的变异系数均低于10％，证明该方法稳定性较好。临床样本检测结果表明，阳性检出率为22.5％,表明该方法敏感性得到进一步提升。
本研究建立了一种敏感、特异、安全的猪附红细胞体检测方法，对猪附红细胞体病的早期预防、及时控制具有重要意义。
本研究依据GenBank发布的猪附红细胞体Eno基因序列，设计合成一对特异性引物，在引物的上下游5’端分别标记上生物素(BIOT)和地高辛(DIG),扩增获得PCR产物。按照PCR-ELISA方法操作，通过优化包被液种类、包被液浓度、结合抗体的反应条件、封闭条件、PCR产物稀释度及显色时间等，确定最优条件。通过检测的30份阴性样本的OD值计算本研究建立的PCR-ELISA方法的临界值。通过检测猪附红细胞体基因组DNA梯度稀释的OD值，测定该方法敏感性。通过扩增猪附红细胞体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫及健康猪血基因DNA片段，检测所建立PCE-ELISA方法的特异性。通过对同一批次、不同批次包被酶标板的重复性试验来检测该PCR-ELISA方法的稳定性。应用所建立的PCR-ELISA方法对延边地区猪场40份猪血液样品检测，并与夏晓辉建立的PCR-ELISA方法比较。
结果表明，常规PCR扩增出大小约为170bp，与预期结果相一致。PCR-ELISA优化结果确定了:包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液、链酶亲和素浓度选择5μg/mL、酶标二抗选择1∶2000、3％ BSA封闭液、2 mg/mL鲑鱼精DNA、封闭时间为60 min、PCR产物稀释30倍以及底物显色15 min等最佳反应条件。确定了本研究建立的PCR-ELISA方法的临界值为0.192。能检测出猪附红细胞体基因组DNA的最低浓度为0.33pg，敏感性较传统PCR方法高10倍。PCR方法与建立的PCR-ELISA方法未检测到猪链球菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体、弓形虫等基因组DNA扩增后的PCR产物，表明该方法具有很好的特异性。批内重复性试验与批间重复性试验结果的变异系数均低于10％，证明该方法稳定性较好。临床样本检测结果表明，阳性检出率为22.5％,表明该方法敏感性得到进一步提升。
本研究建立了一种敏感、特异、安全的猪附红细胞体检测方法，对猪附红细胞体病的早期预防、及时控制具有重要意义。