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目的中枢神经系统退行性疾病是以神经系统中特定的神经元损伤、丢失为主要病理特征的疾病。细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,涉及突触可塑性、行为和认知。在神经退行性疾病病理状态下Cdk5过渡活化导致突触密度降低的同时增加β淀粉样蛋白(Aβ)生成,随后在大脑中导致持续的神经退行性病变。次级运动皮层(M2)在以运动异常为特征的神经退行性疾病中发挥重要作用。CRISPR-Cas9基因编辑系统可以准确、高效地编辑高等生物的细胞基因组DNA,因此在各种人类疾病的基因治疗中展现出广阔的应用前景。本课题构建一个CRISPR/Cas-Cdk5基因组编辑系统,基于次级运动皮层(M2)区Cdk5基因的表达调控,在正常小鼠率先作了初步有效性研究以及作用机制探讨,研究Cdk5对次级运动皮层(M2)神经环路调控及运动功能特异性调控作用,为对后续神经退行性疾病的治疗研究奠定基础。方法1.Cdk5-sgRNA慢病毒载体的设计及体内体外表达验证设计了三对不同的sgRNA序列,并使用CRISPR-Cas9基因编辑策略进行了合成。并将它们分别载入慢病毒载体GV393的相应表达框内,从而构建出针对Cdk5基因的CRISPR-Cas9系统的表达载体LV/Cas9-sgRNA1、LV/Cas9-sgRNA2和LV/Cas9-sgRNA3,并分别进行体外以及体内表达验证。(1)体外HEK293-T细胞转染表达验证分为对照组、LV/Cas9-sgRNA1、LV/Cas9-sgRNA2和LV/Cas9-sgRNA3转染组,在转染3天之后,采用荧光定量观察方法,对各组自带EGFP荧光进行荧光表达验证观察;(2)体内M2区神经元表达验证采用脑立体定位注射方法对实验C57BL/6小鼠随机分为对照组、LV/Cas9-sgRNA3 M2区注射组、阴性载体M2区注射组,脑立体定位注射21天之后采用组织化学方法进行验证,利用免疫荧光染色方法对神经元Cdk5表达进行标记,Western blot法检测LV/Cas9-sgRNA3注射对小鼠M2区Cdk5蛋白表达水平的影响。2.探讨M2区神经元Cdk5缺失之后对小鼠运动调控及作用机制(1)行为活动学调控研究将C57BL/6小鼠随机分为对照组、M2区Cdk5-KD组、阴性载体M2区注射组,注射前3天进行动物筛选,注射后7、14、21、28天利用小鼠自发运动实验以及转棒平衡实验,检测M2区神经元Cdk5缺失对小鼠行为学的影响。(2)采用高尔基染色方法对Cdk5缺失之后M2区神经元的树突以及树突棘进行定量分析;(3)利用脑片电生理技术对Cdk5缺失后神经元突触功能进行测量;将GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱加入记录液中,对细胞兴奋性突触传导形成的mEPSCs进行记录,加入AMPA、NMDA受体拮抗剂,对细胞抑制性突触传导形成的mIPSCs进行记录;M2区第V层刺激,记录分析第II层形成的fEPSP;(4)M2区逆向传导强度标记采用Cdk5缺失区域注射荧光微球(Retrobeads IX),逆向传导3天之后进行脑区冰冻切片的荧光定量分析方法。结果1.CRISPR-Cas9介导的Cdk5-sgRNA慢病毒载体设计及体内体外表达验证(1)设计了3条CRISPR-Cas9敲除Cdk5基因sgRNA序列:sgRNA1 CAGGCTGGAT GATGACGATG、sgRNA2 GTGTGCCAAGTTCAGCCCTC、sgRNA3 TCAGCTTCTT GTCACT ATGC;包装得到了3个基因表达载体:LV/Cas9-sgRNA1、LV/Cas9-sgRNA3、LV/Cas9-sgRNA3。(2)设计的CRISPR-Cas9介导敲除Cdk5基因sgRNA3序列,得到的慢病毒载体在体外HEK293-T细胞转染验证时与其他组相比较表现出较强的活性;M2区该慢病毒三点-3μL立体定位注射后与对照组相比Cdk5蛋白水平降低了约56.7%(p<0.01)。2.探讨M2区神经元Cdk5缺失对小鼠运动调控及作用机制(1)与对照组相比Cdk5-KD组在7和14天时没有运动表现差异,在21天和28天时运动的总距离和身体旋转的总数均显着降低(p<0.001);同样,与对照组相比,Cdk5-KD组在21天和28天时表现出较差协调性和落棒潜伏期缩短(p<0.01)。(2)高尔基染色显示在M2区Cdk5缺失后,M2区域的神经元树突密度较其他皮层区域相比较变得稀疏,与对照组相比Cdk5-KD组树突长度显著变短(p<0.001)。量化了V层锥体神经元树突上的脊柱密度发现与对照组相比Cdk5-KD组每10μm的树突棘密度显着降低(p<0.001)。PSD-95蛋白免疫荧光染色结果显示,与NC组相比Cdk5-KD组与EGFP标记的神经元重叠的红色荧光数量明显变少。(3)fEPSP检测结果显示,随着刺激强度的增加,与对照组相比,Cdk5-KD组显示出更小的fEPSP斜率(p?<?0.001)。全细胞记录显示,与对照组相比Cdk5缺失神经元mEPSC的频率降低了约50%(p<0.001),以及mEPSC的平均振幅也降低(p<0.005);并且,在mIPSC的记录也显示频率与振幅均降低(p<0.005)。(4)荧光逆行示踪剂注射显示,与对照组小鼠相比,Cdk5-KD组小鼠M2区向同侧前额叶皮层、屏状核和丘脑前丘脑核投射强度明显较低(p<0.001)。结论1.针对退行性神经疾病新靶点:Cdk5,CRISPR-Cas9介导的sgRNA序列“TCAGCTTCTTGTCACT ATGC”,可以对在体神经元中Cdk5基因组精确及有效地进行切割,抑制Cdk5的表达,是一种高效便捷的Cdk5基因编辑系统。2.正常小鼠M2区Cdk5缺失后,可调控小鼠的运动功能;这种运动功能的改变的机制为,M2区神经元Cdk5缺失,导致包含兴奋性和抑制性突触在内的总体脊柱密度降低、从而减少神经元之间以及脑区之间信号传导,对运动造成了影响。但是神经退行性疾病状态,CRISPR/Cas-Cdk5基因组编辑系统发挥的功能作用是否也是一样有待进行研究。