癌症是困扰人类的最严重的疾病之一,全球每年都会有数万人被癌症夺走性命,针对癌症治疗的研究一直是人们关注的重点。癌症的发生和发展受到诸多因素的影响,因此利用多种药物通过多种途径对肿瘤细胞进行杀伤,可以提高对肿瘤细胞、尤其是耐药型细胞生长的抑制效率,降低给药剂量。近年来联合治疗、多靶点治疗已经成为人们研究的热点之一。高分子药物载体在联合治疗方面有较大的优势。首先,聚合物载体可以通过被动靶向效应在肿瘤中富集,提高药物在病灶部位的浓度、降低药物对正常组织脏器的影响;其次,聚合物载体可以通过对功能性单元进行调整,搭载类型完全不同的药物;最后,通过聚合物载体进行联合治疗可以方便高效地控制各类药物的比例,避免因药物比例失衡造成的毒副作用或疗效稳定性下降。为了分别在体外、体内环境下实现对耐药型肿瘤细胞MCF-7/DOX的有效抑制、杀伤,本课题设计、合成了PEG-b-P(MEMA-SS-KLAK)-b-PHEMASN38 聚合物载体,实现了对 SN38、KLAK肽和survivin siRNA的联合给药,分别通过抑制DNA复制、破坏线粒体和沉默抗凋亡基因survivin二个途径对肿瘤细胞进行进攻。本三嵌段聚合物载体通过RAFT反应进行合成,通过分别控制PEG、P(MEMA-SS-KLAK)和PHEMASN38嵌段的分子量,得到了 9组聚合物,以纳米沉淀法制备胶束并进行初筛之后,对其中的3M、4M和9M (3M组成为 PEG114-P(MEMA-SS-KLAK)5-PHEMASN3820,4M、9M 的组成不在此赘述)进行了详细的结构、功能表征。首先,对3M、4M和9M的物理化学性质进行了确认。在通过1H NMR及GPC对聚合物的分子量进行计算之后,分别以动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)考察了相应胶束的粒径大小与分布。由于KLAK肽所携带的较高的正电荷,具有作为基因载体的潜质,电泳实验结果证明KLAK可以对siRNA进行高效吸附、搭载,并有效防止siRNA降解。同时,搭载siRNA可以对胶束的表面电荷性质造成显著影响,并且这种影响既与电荷中和有关,也与KLAK二级结构的形成有关。圆二色谱(CD)结果证实了 KLAK二级结构在聚合物胶束中的保留,并验证了 siRNA对αα-螺旋形成的促进作用。药物释放实验结果表明KLAK可以在还原性物质的作用下高效释放,SN38则需在pH较低的环境中才能断裂酯键、从主链解离。在此基础上,本实验进一步对胶束在细胞水平的生物功能进行了考察。由于阳离子载体KLAK的影响,耐药型细胞MCF-7/ADR对各组胶束内吞的速率均较快,并且流式细胞仪的实验结果表明,内吞速率与胶束中未占用的氨基成正比。内吞途径方面,胶束主要通过大胞饮(macropinocytosis)和穴样凹陷(caveolae-mediatedendocytosis)被细胞摄取,因此吞噬泡(endosome)很可能可以避免与溶酶体融合,提高转染效率。分别通过JC-1试剂盒和5’-FAM荧光素标记的siRNA验证了 KLAK对于线粒体的破坏能力和siRNA从吞噬泡中逃逸至细胞质的能力,与无还原响应性胶束NC micelles的实验对比结果表明,KLAK从聚合物主链中的解离对于发挥其生物功能是必不可少的,同时提出了关于“二硫键断裂的时间点”的猜想。最后,细胞毒性实验和凋亡检测实验证明了多重载药胶束相比游离药物可以更有效地对肿瘤细胞进行杀伤,并且通过荧光素酶(luciferase)检测、qPCR和Western Blot分别在表型、mRNA和蛋白水平验证了胶束在siRNA转染上的有效性。最后,本文对胶束在动物水平的功能进行了考察。胶束在小鼠体内生物分布的结果表明,粒径和电荷的差异会严重影响胶束在肿瘤和各脏器中的分布效果,siRNA的搭载会通过影响胶束表面电荷而改变生物分布和瘤内分布结果。肿瘤生长抑制实验中,3Mf和3Msur胶束良好地抑制了MCF-7/ADR实体瘤的增殖,而4Msur和9Msur虽然具有较高的肿瘤细胞杀伤能力,却因为生物分布差,未能实现有效的肿瘤抑制,这表明在评估胶束的抗肿瘤能力方面,生物分布水平会比细胞实验各项水平具有更高的权重。肿瘤切片的免疫荧光染色结果表明,搭载KLAK的胶束可以有效地对肿瘤血管进行杀伤,提高抑瘤效果。毒副作用评估方面,各组载药胶束均未对小鼠的行为形态、组织脏器功能造成显著影响。由于细胞实验结果显示PEG-b-P(MEMA-SS-KLAK)-b-PHEMASN38聚合物胶束的还原响应性很可能发生在细胞内吞开始时,而非多数文献报道的胶束脱离吞噬泡/溶酶体、进入细胞质之后,因此本实验进一步合成了 PHPMA-(SS)-PDMAEMA-(SS)-PHEMASN38 三嵌段聚合物以及其他具有还原响应性、被荧光素标记的载体,考察二硫键在细胞内吞过程中的断裂时机,并比较二硫键在聚合物中位置的不同对于胶束所携带siRNA的转染效率的差异。实验结果表明,二硫键的断裂确实是在内吞开始进行或刚进行不久后发生的,虽然二硫在聚合物中的位置对于PHPMA-(SS)-PDMAEMA-(SS)-PHEMASN38 的转染效率没有显著影响,但通过与 PEG-b-P(MEMA-SS-KLAK)-b-PHEMASN38 对比,可以确定以KLAK作为基因载体时可发挥比传统阳离子载体更高的效率。