碳纳米管(Carbonnanotubes,CNTs)自1991年被发现以来,以其独特的理化性质和较好的生物相容性被广泛研究和利用。与此同时,CNTs也大量进入环境中,对生态系统造成的影响日益增加,其毒性研究也逐渐受到重视。五氯酚(pentachlorophenol,PCP)及其钠盐作为一种除莠剂和杀虫剂,在上世纪九十年代之前被大量使用,虽已停产并禁用,但由于其在环境中不易降解,目前还有大量PCP残留在环境中,有机污染物PCP与大分子材料CNTs复合后又会产生新的毒性效应。赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)作为土壤生态系统中的标准受试生物,已有CNTs对其毒性的研究,但蚯蚓在个体水平上的毒理学试验耗时长,实验动物用量大,且灵敏度不高,其实际应用非常有限。而细胞试验耗材少、速度快、灵敏度高,且细胞的毒性指标与个体毒性指标又有一定的相关性,可在很大程度上反应个体水平的毒性。本研究对探索了赤子爱胜蚓体腔细胞的体外培养方法,并通过体外染毒,研究了 CNTs和PCP-Na单独或联合作用下对蚯蚓细胞的急性毒性、氧化损伤、基因损伤和膜结构损伤的影响。同时研究了 CNTs和PCP-Na对赤子爱胜蚓的生殖毒性试验,从多层面探讨两种受试物的毒性机理。本研究主要结果如下:(1)赤子爱胜蚓体腔细胞在体外可以悬浮状态进行原代培养。用96孔板培养时,最佳培养条件为温度25℃、培养基为RPMI-1640培养基、不通CO2、细胞浓度为2-4×104个/孔(1-2×105个/mL),培养时间为24h。细胞存活率可达100%。(2)赤子爱胜蚓体腔细胞体外培养染毒,PCP-Na的LC50为104.46mg/L,其毒性介于蚯蚓个体人工土壤试验染毒第7天和第14天急性毒性之间。而与浓度为50mg/L的CNTs复合染毒试验中,直接添加复合染毒LC50为109.39 mg/L,CNTs吸附PCP-Na后染毒LC50为112.92 mg/L,两种方法复合染毒后急性毒性都略有减小。碳纳米管急性毒性非常小,试验中未测得其LC50值,这与个体水平上的急性毒性试验结果一致。(3)碳纳米管与五氯酚钠都对细胞产生氧化损伤,产生ROS,并能引起脂质过氧化,生成MDA。低胁迫下,细胞能作出应激反应,SOD活性增大,高胁迫下,SOD活性降低。CAT是最不敏感的生物标志物。这与个体水平上研究结果类似。(4)用彗星试验评价蚯蚓受两种受试物的胁迫作用,较为灵敏。试验结果显示,各染毒组与对照组相比均有显著性差异,碳纳米管单独染毒时,其与DNA损伤有明显的剂量-效应关系。而五氯酚钠单独染毒时,浓度较高的染毒组DNA损伤反而较小。CNTs与PCP-Na两者复合染毒时,其遗传毒性大于受试物单一染毒时的毒性,表现出一定的协同作用。试验结果与个体水平上彗星试验的结果类似。(5)高浓度五氯酚钠、50mg/L碳纳米管组以及复合染毒组均能对细胞的膜结构造成损伤,增加细胞膜的通透性,并降低细胞的线粒体跨膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)。五氯酚钠对膜的损伤比较大,两者复合染毒后,对细胞膜的毒性降低,两种污染物呈拮抗作用。受试物对细胞膜结构的损伤程度与MDA含量有一定的相差性,表明对膜结构的损伤主要是氧化损伤。(6)个体水平上生殖试验结果表明,游离态的碳纳米管可能会对蚯蚓生长起到一定的促进作用。高浓度的五氯酚钠具有较强的生殖毒性,会明显减少蚯蚓蚓茧的产量,低浓度的五氯酚钠对蚯蚓生长的影响较大,但做为补偿,蚯蚓的平均产茧量有所提高。碳纳米管对蚯蚓的生殖毒性较低,其与五氯酚钠复合染毒时,五氯酚钠的生殖毒性也降低,且吸附后添加的生殖毒性比直接添加的要低,表明是碳纳米管的吸附作用降低了游离态五氯酚钠的浓度,从而降低其生殖毒性。综上所述,细胞毒性试验各指标都要比个体水平指标灵敏,且与个体水平毒性测定结果有一定的正相关性。细胞毒性试验有望取代蚯蚓个体水平的毒性试验成为新的快速、高效、灵敏的研究污染物对土壤生物毒性的方法。