论文部分内容阅读
沙丁胺醇(salbutamol，SAL)和莱克多巴胺（ractopamine，RAC）是我国违禁的动物促生长剂，违禁使用现象严重。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点，在食品安全监测中具有突出的优势。目前，针对这两种药物的免疫分析研究不够深入，抗体与药物的免疫反应识别机制未见报道，已建立的免疫分析方法存在灵敏度低、特异性低的缺点，另外还存在难以实现两种药物同时检测的局限性。针对以上问题，本文以沙丁胺醇和莱克多巴胺为研究对象，借助同源模建和分子对接技术研究这两种药物与其单克隆抗体的免疫识别机制，并开展高灵敏度免疫分析方法和双对象同时检测的免疫检测技术研究，主要研究结果如下：
⑴SAL和RAC单克隆抗体免疫识别机制分析。通过半抗原合成、免疫动物、细胞融合筛选，获取了针对SAL的单克隆抗体(anti-SAL monoclonal antibody，anti-SAL-Mab)和针对RAC的单克隆抗体(anti-RACmonoclonal antibody，anti-RAC-Mab)，这两种单克隆抗体的特异性高，交叉反应低。采用通用引物从分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆抗体可变区全套基因，经过国际免疫基因信息数据库(the international ImMunoGeneTics information system，IMGT)比对分析，发现两种单克隆抗体可变区基因来源于不同的鼠源抗体胚系等位基因。比较这两种单克隆抗体可变区的蛋白序列，发现轻链蛋白序列同源性有62.83％，而重链蛋白序列同源性仅有45.16％。利用同源模建技术分别构建这两种单克隆抗体可变区的三维模型，发现模型的骨架区叠合程度高，但抗原互补决定簇(complementaritydetermining regions，CDR)叠合程度低。利用分子对接技术，发现抗原结合口袋的形态以及活性氨基酸残基是免疫识别的关键因素。
⑵SAL和RAC多种化学发光酶免疫分析方法的建立。基于anti-SAL-Mab，按照优化方案，采用最佳的包被浓度、最佳的抗体稀释倍数和最佳反应时间等优化条件，分别建立了直接竞争化学发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)和生物素-亲和素系统联用间接竞争化学发光酶免疫分析(Biotin avidin-CLEIA，BA-CLEIA)。直接竞争CLEIA灵敏度高（IC50=4.34ng/mL），比基于同-anti-SAL Mab的ELISA灵敏度（IC50=24.3ng/mL）高。BA-CLEIA灵敏度IC50为1.9ng/mL，和直接竞争CLEIA的灵敏度（IC50=4.34ng/mL）在同一水平上，生物-亲和素系统对灵敏度没有显著影响。基于anti-RAC-Mab，选择RAC-OVA作为同源包被原，对羟基苯丙酸(p-hydroxyvbenzene propanic acid，PHPC)偶联OVA作为异源包被原，经过优化程序，分别建立了同源包被模式和异源包被模式RAC-CLEIA。同源模式RAC-CLEIA的灵敏度(IC50=0.183ng/mL)比基于同一anti-RAC-Mab的ELISA(IC50=0.9ng/mL)提高5倍。而异源模式RAC-CLEIA的灵敏度更高（IC50=0.017ng/mL），比同源模式RAC-CLEIA提高近10倍。
⑶同时检测SAL和RAC的双标记时间分辨免疫分析方法的建立。基于anti-SAL Mab和anti-RAC Mab，本论文首先分别建立SAL-Eu3+-TRFIA和RAC-Sm3+-TRFIA，为双标记模式同时分析SAL/RAC提供基础数据。在此基础上，研究发现两种标记抗体不存在药物交叉反应性，混合包被和混合抗体对同时检测两种信号之间无严重干扰，选择最优的混合包被浓度(SAL-OVA，1.25μg/mL; RAC-OVA，7.8μg/mL)、混合抗体浓度(SAL-Eu3+Mab，1：1000，RAC-Sm3+Mab，1：200)，在统一的缓冲体系之下进行免疫反应，成功建立SAL/RAC-dl-TRFIA双标记时间分辨免疫分析方法。SAL/RAC-dl-TRFIA对SAL的IC50为5.7ng/mL（检测范围为1-25.78ng/mL），对RAC的IC50为1.08ng/mL（检测范围0.32-3.3ng/mL），添加回收率80-120％，变异系数低于20％。
本研究为认识药物与抗体之间的免疫识别机制提供了新的思路和技术手段。另外，本论文建立的免疫分析方法为开发沙丁胺醇和莱克多巴胺两种兽药的新型免疫分析试剂盒奠定基础，同时为食品中其他小分子有害物的监管提供了参考。