论文部分内容阅读
甲基对硫磷水解酶MPH（Methyl Parathion Hydrolase）来源于邻单胞菌属中的一种能降解甲基对硫磷的菌株M6。MPH可以有效并特异性的降解甲基对硫磷,甲基对硫磷与对氧磷、对硫磷等含碳-磷键或含有机基团的磷酸衍生物等有机磷化合物,是有机磷杀虫剂、有机磷除草剂、有机磷神经毒气等的主要成分。对生物体的毒性主要表现为抑制乙酰胆碱酯酶的活性,造成神经突触后膜上的乙酰胆碱大量积累,从而导致神经系统的过度刺激。由于有机磷农药在许多国家被大量使用,导致了严重的水、土壤、大气环境污染和生态破坏,严重威胁着人类的生命安全。虽然目前已发现了多种有机磷水解酶,但是表达量低,生产成本高等原因阻碍了其工业化生产。本研究转化甲醇营养型毕赤酵母GS115得到了高产量的甲基对硫磷水解酶菌株。实验的结果如下:1.甲基对硫磷水解酶MPH-R的基因合成在NCBI中搜索到邻单胞菌Plesiomonas sp.M6来源的甲基对硫磷水解酶MPH的基因序列并去掉了mph基因中的原始信号肽序列,在其末端添加6个组氨酸标签。翻译成氨基酸序列之后,按照毕赤酵母的密码子偏爱性设计overlapping PCR引物,合成新的基因序列mph-R基因全长为912bp,共编码304个氨基酸。2.MPH-R表达载体的构建和表达将合成好的基因通过酶切酶连的方法连接到pHBM905BDM表达型载体,得到pHBM905BDM-mph-R。SalⅠ线性化酶切载体之后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。筛选出阳性菌落接种于BMGY培养基摇瓶发酵。在48小时甲醇诱导后,500mL摇瓶中MPH-R的表达水平增加至1.9 U/mL,比酶活为15.8 U/mg。且在5 L基础盐高密度发酵培养基中表达量增加至18.4U/mL,将表达量再次提高了9.7倍。到目前为止MPH已成功的在毕赤氏酵母中分泌表达,报道过的野生型MPH在毕赤酵母中的表达量约为0.03 U/m L,用其它方法优化过的MPH表达量约为0.48 U/mL,还达不到工业生产的表达水平。我们通过改变MPH-R的信号肽以及按照毕赤酵母密码子偏好性优化密码子的方法提高表达量,实验数据表明本实验重组蛋白MPH-R在毕赤酵母中的表达水平是野生型MPH的62倍,是其它文献中优化MPH的4倍。3.MPH-R的纯化和酶学性质研究使用Ni-NTA亲和层析纯化的方法纯化MPH-R。经测定该酶的最适温度为39℃,最适pH为11。金属离子作为添加剂检测MPH-R活性的变化,当浓度为1mM时,Ni2+、Co2+和Mg2+能有效增加MPH-R的活性,分别达到了196%、201%和154%。4.MPH-R固定化研究选用壳聚糖为固定化载体材料,戊二醛为交联剂固定化机磷水解酶MPH-R。壳聚糖是具有好的生物相容性和对环境友好的材料,能有效的通过共价键结合MPH-R,并且较游离酶提高了MPH-R催化效率。通过比较游离的MPH-R与固定化的MPH-R酶学性质发现:虽然固定化酶与游离酶的最适温度及最适pH相近,但是固定化酶对不同的温度和pH的适应性更强,具有更高的活性,且壳聚糖固定化酶热稳定性和pH耐受性较游离酶得到了明显的提升。固定化酶最大的优势是可以回收再利用,进行多次重复反应。本实验中壳聚糖固定化MPH-R在经过100次重复使用后,仍能保持约50%以上的活性。壳聚糖固定化酶优异的特性为其工业化发展提供了良好的选择。