【摘 要】
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木质纤维素是世界上最广泛、最丰富、最廉价的可再生性生物资源，木糖是其水解后的主要成分之一，因而对木糖生物转化的研究是充分开发利用木质纤维素的基础和关键环节。木糖代谢
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木质纤维素是世界上最广泛、最丰富、最廉价的可再生性生物资源，木糖是其水解后的主要成分之一，因而对木糖生物转化的研究是充分开发利用木质纤维素的基础和关键环节。木糖代谢的中间产物主要有木糖醇、木酮糖等，其代谢产物是乙醇。目前对于木糖代谢的研究主要集中于如何生产有较大市场潜力的木糖醇和被给予厚望的未来燃料-燃料乙醇。而木糖醇代谢工程和酒精代谢工程都面临着两个共同的主要问题：氧化还原不平衡问题和木糖跨膜运输问题。
针对目前研究中所用的木糖醇脱氢酶基因来源单一(主要是来源于Pichiastipitis)及氧化还原不平衡问题，本研究首先通过PCR-RFLP分析和rDNA序列分析鉴定了实验室筛选到的能够良好利用木糖的四株菌Xu264、Xu280、Xu315、Xu316、Xu475，其中Xu264为Candidamaltosa。然后通过同源克隆的方法首次克隆到了Candidamaltosa的木糖醇脱氢酶基因(CM-xdh)，并在E.coli和S.cervisia中获得了表达。在此基础上，本研究通过顺式PCR的方法对CM-xdh进行定点突变后在E.coli中获得了表达。
所克隆的CM-xdh大小为1095bp，编码363个氨基酸。在E.coli中表达经His-tag纯化后的融合蛋白SDS-PAGE电泳显示分子量在42.7kDa左右，其最适PH值为7.6，最适温度为35℃。该酶专一性的以NAD+为辅酶，其Km值为0.485mM。
经过D207A、I208R、F207S三点突变后，在E.coli中表达经His-tag纯化后的融合蛋白获得了NADP+的活性，其Km值为2mM，同时对于NAD+的催化效率降低了18.5倍，对于NADP+的催化效率是NAD+的9.6倍。这一研究结果表明该融合蛋白的辅酶特异性发生了逆转，主要以NADP+为辅酶进行反应。
该研究结果表明通过蛋白质工程可以改变NAD+依赖性的木糖醇脱氢酶(XDH)活性为NADp+依赖性，从而使之与NAD+依赖性的木糖还原酶(XR)相匹配以解决木糖代谢研究中的氧化还原不平衡问题。
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