Draize试验自上世纪40年代创立以来在化学品的眼刺激性毒理学安全性评价，保护人群健康方面做出了巨大贡献，但Draize试验在一定程度上存在评分标准主观性强，实验室间重复性差和动物承受痛苦较大等缺点。近年来，随着社会动物福利和动物保护意识的提高，“3R”(减少Reduction，优化Refinement，替代Replacement)理论不断深入人心，使得Draize试验面临着越来越多的批评和谴责。2003年欧盟在化妆品规程(76/768/EEC)第7次修正案(2003/15/EC)规定从2013年起禁止使用动物进行化妆品原料的毒理学安全性评价，逐步不允许成员国从外国进口和销售进行过动物试验的化妆品。2007年6月1日正式实施的REACH法规要求所有化学品的安全评估必须采用最少的试验动物，以促进非动物试验的研究和开发。为此，许多发达国家和地区相继开展了眼刺激性替代方法的研究与评价工作，迄今已建立的体外替代方法主要包括离体器官模型、绒毛膜尿囊膜试验、细胞毒性与功能试验、体外组织重组模型等多种眼刺激性替代方法，其中一些眼刺激性替代方法处于评估阶段。　　 然而众多研究均表明迄今尚没有任何一种单一替代方法可完全替代Draize试验。主要原因可能是单一替代方法尚难以完全模拟所有组织的反应，因此许多学者建议采用一组作用机制不同、检测终点互补的体外试验组合来替代Draize试验。目前OECD推荐使用逐步检测策略预测化学品的眼刺激性，即先通过文献资料、理化性质等评估化学品的眼刺激性，然后进行替代试验，最后对还不能确定眼刺激性的物质才进行少量动物试验。目前眼刺激性替代方法的研究主要集中于建立单一试验方法及其适用性研究，关于体外替代方法的优化组合研究报道甚少，降低了眼刺激检测策略中应用替代方法的可操作性。　　 本课题组近年在国内率先建立了6种眼刺激性替代方法，分别为：鸡胚绒毛膜尿囊膜试验(Hens egg test on the chorioallantoic membrane，HET-CAM)、绒毛膜尿囊膜-台盼蓝染色试验(chorioallantoic membrane-try pan blue straining，CAM-TBS)、中性红摄入试验(the Neutral Red Uptake assay，NRU)、红细胞溶血试验(red blood cell，RBC)、荧光素漏出试验(Fluorescein leakage test，FLT)以及离体兔眼试验(Isolated rabbit eye，IRE)。在此基础上，张文改等通过研究探索性地提出了染发剂和护发剂的检测程序，分别采用了HET-CAM+CAM-TBS+FLT和RBC+CAM-TBS组合，两个程序对受试染发剂和护发剂的预测结果与Draize试验的分级一致率为94.1％。关于化妆品原料和其他健康产品等化学品的眼刺激性替代方法优化组合研究报道较少。随着欧盟REACH法规的实施以及2013年化妆品及原料的毒理学安全性评价动物试验禁令期限的日益逼近，我国面临着欧盟设置的技术贸易壁垒的困扰，因此尽快建立合适的眼刺激性替代方法应用程序，为眼刺激性替代方法早日应用于各类化学物质的毒理学安全性评价提供技术支撑十分必要和迫切。　　 基于此现状，本课题开展了化妆品原料和农药眼刺激性替代方法应用程序的研究，为推动我国动物试验替代方法的发展，提高我国产品的市场竞争力，突破体外替代方法造成的国际贸易技术壁垒奠定了技术基础，从而具有重要的战略意义和巨大的经济价值。　　 研究目的:　　 1.建立化妆品原料眼刺激性替代方法应用程序，并对应用程序进行评估。　　 2.通过同步比对眼刺激性替代方法和Draize试验的检测结果，建立农药眼刺激性替代方法应用程序，并对应用程序进行初步评估。　　 材料与方法:　　 1.受试材料:　　 4类28种已知眼刺激性的化妆品原料(包括表面活性剂、溶剂、助剂和添加剂类)眼刺激性数据；4类25种未知眼刺激性的化妆品原料；3类28种市售农药产品(包括杀虫剂、杀菌剂和除草剂类农药)。　　 2.眼刺激性替代方法:　　 6种眼刺激性体外替代方法，包括3T3-NRU、RBC、HET-CAM、CAM-TBS、FLT和IRE。　　 3.兔眼刺激性试验:　　 参照我国卫生部《化妆品卫生规范》(2007年版)和GB15670-1995《农药登记毒理学试验方法》，选用健康成年白色新西兰家兔进行传统的兔眼刺激性试验，即Draize试验。　　 4.统计学方法:　　 (1)计算每种眼刺激性替代方法区分不同刺激级别受试物的预测能力，评估指标包括灵敏度、特异度和受试者工作曲线(receiver operator characteristic curve，ROC)下面积。　　 (2)采用判别分析分别对多种优化组合建立相应的预测模型。　　 (3)以Draize试验结果为参照标准，对眼刺激性替代方法应用程序的预测分级结果进行McNemar-Bowker检验、Kappa检验和相关系数的计算，以评价应用程序的预测能力。　　 5.化妆品原料眼刺激性替代方法应用程序的建立和评估:　　 (1)6种替代方法预测能力比较。　　 本课题组已建立了6种眼刺激性替代方法，并采用各替代方法分别检测了的4类28种化妆品原料的眼刺激性。在此试验数据基础上，以Draize试验结果为参照标准，评估各替代方法对不同眼刺激级别受试物的预测能力，指标包括灵敏度、特异度和ROC工作曲线下面积。　　 (2)最适预测模型的建立与评估。　　 选用预测能力较强的眼刺激性替代方法，设计多种替代方法优化组合。采用判别分析建立相应的预测模型。根据预测模型与Draize试验的分级一致率和实施可行性等因素，确定最佳预测模型。　　 (3)化妆品原料眼刺激性替代方法应用程序的建立与评估。　　 综合考虑预测模型中各替代方法的预测能力和可操作性等因素，确定各替代方法在应用程序中的检测次序，建立应用程序。将4类28种已知眼刺激性分级的化妆品原料的各替代方法分级结果回代入应用程序，初步评估应用程序的预测能力。　　 另选4类25种未知眼刺激性分级的化妆品原料，采用应用程序进行眼刺激性评估，然后同步进行6种替代方法和Draize试验，根据试验结果评估应用程序对未知眼刺激性分级的化妆品原料的预测能力。　　 6.农药眼刺激性替代方法应用程序的研究:　　 (1)6种替代方法检测农药眼刺激性的适用性研究。　　 选用市场上用量较大的3类20种农药(杀虫剂、杀菌剂和除草剂)同步进行6种替代方法和Draize试验。以Draize试验结果为参照标准，进行各替代方法与Draize试验相关性和一致性检验，评估每种替代方法是否可用于农药的眼刺激性检测。计算并评估可用于农药眼刺激性检测的替代方法对不同刺激级别农药的预测能力。　　 (2)最适预测模型的建立与评估。　　 农药眼刺激性替代方法最适预测模型的建立与评估过程与化妆品原料眼刺激性替代方法最适预测模型类似。　　 (3)应用程序的建立与评估。　　 农药眼刺激性替代方法应用程序的建立与评估过程与化妆品原料眼刺激性替代方法应用程序类似。将3类20种农药的试验数据回代入应用程序，初步评估应用程序的预测能力。　　 另选3类8种不同农药采用应用程序进行眼刺激性评估，然后同步进行6种替代方法和Draize试验，根据试验结果评估应用程序的预测能力。　　 结论:　　 1.首次建立了化妆品原料通用的眼刺激性替代方法应用程序。经评估发现化妆品原料通用的应用程序预测结果与Draize试验分级结果具有较高的相关性和分级一致，认为化妆品原料通用的眼刺激性替代方法应用程序可替代Draize试验用于化妆品原料眼刺激性的检测。　　 2.首次提出了三类用量较大农药的通用眼刺激性替代方法应用程序，预测结果与Draize试验结果分级的相关性和一致性较好。经初步评估后认为该应用程序可用于杀虫剂、杀菌剂和除草剂三类农药眼刺激性的初筛评价。