第一部分Egfl7在喉癌组织中的表达测定及临床意义 目的：探讨Egfl7（Egf-likedomain7）在喉鳞状细胞癌（LSCC）组织中的表达及意义。 方法：采用RT-PCR和Western-blot方法检测33例新鲜喉癌组织和配对的癌旁非癌喉组织（NCLT）中Egfl7mRNA和Egfl7蛋白的表达；采用免疫组化方法检测116例喉癌组织中Egfl7蛋白的表达；采用Cox多因素回归法，结合临床随访资料和临床病理资料分析，研究Egfl7的表达与临床病理特征和预后的关系。 结果： 1.33例新鲜喉癌标本中，LSCC组织中Egfl7mRNA的阳性表达率87.9％（29/33）显著高于NCLT的阳性表达率33.3％（11/33）（P<0.01）。LSCC组织中Egfl7mRNA的平均表达水平也明显高于NCLT（1.42±0.21/0.86±0.11，P=0.008）。同一批样本中LSCC中Egfl7蛋白的阳性表达率90.9％（30/33）显著高于NCLT阳性表达率27.3％（9/33）（P<0.01）。Egfl7蛋白在LSCC组织中的平均表达水平也明显高于NCLT组织（0.97±0.21/0.41±0.13，P=0.001）。且Egfl7mRNA和Egfl7蛋白表达具有显著相关性（R=0.786，P<0.01）。Egfl7mRNA和Egfl7蛋白的表达水平与LSCC的临床分期、肿瘤的直径大小及有无淋巴结转移等临床病理特征明显相关（P<0.05）。Egfl7mRNA和Egfl7蛋白的表达水平和MVD呈正相关性（R=0.842，P=0.231）。 2.Egfl7蛋白阳性表达绝大多数位于细胞浆内。在116例LSCC组织中Egfl7蛋白阳性表达率为81.03％（94/116），Egfl7蛋白阴性表达率为18.97％（22/116）。 3.Egfl7蛋白表达与LSCC的临床分期（P=0.003）、肿瘤的直径大小（P=0.001）及有无淋巴结转移（P=0.002）明显相关。Egfl7蛋白在喉癌组织中的表达水平与患者性别、年龄、癌灶原发部位无关（P>0.05）。116例喉癌中Egfl7++/+++组67例，Egfl7-/+组49例，患者平均生存时间为36.9月，中位生存时间为43.2月。116例中55例在5年内死亡，在死亡病例中40例为Egfl7++/+++组，15例为Egfl7-/+组，两组之间具有显著性差异（P=0.007），Egfl7++/+++组喉癌患者手术后生存率低于Egfl7-/+组。采用Cox多因素回归分析，结果发现Egfl7蛋白表达（RR，1.74；P=0.012），淋巴结转移（RR，1.52；P=0.015）是喉鳞癌预后的独立预测因子。 结论： 1.Egfl7可能参与了喉癌的发生发展； 2.Egfl7蛋白可能成为预测喉癌的不良预后的肿瘤标志物。 第二部分RNAi干扰Egfl7对喉癌细胞肿瘤生物学行为影响的体内外研究 目的：探讨靶向沉默Egfl7的表达对LSCC侵袭转移的作用机制。 方法：构建pSUPER.Retro.neo逆转录病毒小RNA干扰质粒，转染PT67包装细胞，获得病毒颗粒并瞬时二重感染Hep-2喉癌细胞系，干预沉默Hep-2中Egfl7的表达，体外采用划痕实验、Transwell侵袭实验、MTT和流式细胞仪检测等方法，研究喉癌细胞株Hep-2分泌Egfl7调控喉癌细胞分化增殖、喉癌侵袭运动的分子机制。体内采用裸鼠成瘤实验研究体内抑制Egfl7的表达对喉癌细胞成瘤能力的影响。 结果： 1.本研究成功构建了靶向Egfl7的siRNA质粒和对照组表达质粒。 2.获得了稳定表达序列1和序列C的Hep-2细胞系，分别命名为Hep-2Egfl7RNAi+和Hep-2Egfl7RNAi-。 3.Westernblot结果显示：Hep-2Egfl7RNAi+中Egfl7的表达被明显抑制。 4.体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制喉癌细胞的侵袭迁移。 5.体外实验中抑制Egfl7的表达不影响喉癌细胞的增殖和凋亡。 6.体内裸鼠成瘤实验结果：体内抑制Egfl7的表达可以抑制喉癌细胞的成瘤能力。 比较MiceEgfl7RNAi+和MiceEgfl7RNAi-两组裸鼠模型中Hep-2原发瘤的大小：皮下种植45天后Hep-2原发瘤的大小（cm3）分别为3.01±0.22和3.45+0.23，差异具有显著性意义（P<0.05）。 结论： 1.Egfl7在喉癌侵袭转移中发挥关键性作用； 2.Egfl7可能成为抗喉癌侵袭转移的基因治疗新靶点。 第三部分Egfl7调控喉癌新生血管生成的体内外研究 目的：探讨靶向沉默Egfl7的表达对LSCC血管生成的作用机制。 方法：干预沉默人微血管内皮细胞系（HMEC-1）中Egfl7表达，体外采用划痕实验、Transwell侵袭实验、二维和三维血管成管实验、MTT和流式细胞仪等方法检测，研究喉癌细胞株Hep-2分泌Egfl7调控喉癌细胞分化增殖、喉癌侵袭运动和喉癌血管成管的分子机制，体内采用三维共培养的细胞接种裸鼠成瘤实验验证Egfl7调控喉癌血管成管的分子机制导致肿瘤生物学行为的改变。 结果： 1.逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默HMEC-1人微血管内皮细胞系中Egfl7的表达。感染HMEC-1的效率为80％～90％。Westernblot检测结果：实验组HMEC-1Egfl7RNAi+较对照组HMEC-1Egfl7RNAi-Egfl7蛋白表达明显下降，分别为0.36±0.07和0.86±0.02（P<0.05），这提示成功地抑制了HMEC-1细胞中Egfl7的表达。 2.体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制人微血管内皮细胞（HMEC-1）的迁移。 3.体外实验中抑制Egfl7的表达不影响人微血管内皮细胞（HMEC-1）的增殖和凋亡。 4.体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制人微血管内皮细胞（HMEC-1）的血管生成。 5.体内实验中抑制Egfl7的表达可以抑制VEGF诱导的血管生成。 结论： 1.Egfl7可能通过调控血管成管分子机制参与了喉癌的侵袭转移； 2.Egfl7可能成为抗喉癌血管生成的基因治疗新靶点。