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轮状病毒（Rotavirus,RV）感染是引起婴幼儿及其他幼龄哺乳动物非细菌性腹泻最重要的原因,全世界因急性腹泻入院的儿童中,约60%左右为RV感染引起,因轮状病毒每年导致的死亡病例高达80万。我国儿童RV感染率和住院率分别为28%-65%和30-50%,造成相当大的的社会负担和经济损失。目前针对轮状病毒的治疗没有有效的药物,市场上现有的疫苗在不同地区作用效果差距较大,价格昂贵且存在发生潜在感染的安全隐患,因此研发安全性可靠、高效廉价的疫苗的成为当前比较重要的项目。而动物模型不仅可以研究病毒的感染进程和致病机理,同时也可以为疫苗的研发和药物的筛选提供基础性保障。目前轮状病毒的感染动物模型主要包括乳鼠、无菌猪、猴和大鼠等,由于这些模型在亲缘关系、实验周期、解剖学特性等方面的局限性,并没有动物模型的验证和清晰阐明病毒的致病机制。近年来,树鼩由于体型小、繁殖快、饲养成本低以及解剖学特性与人相近而受到重视,并且已经初步证实可以感染轮状病毒,因此成为研究轮状病毒的比较优势的动物。首先选择G1P[8]型的WA株和从临床病人粪便中分离培养的G9P[8]的JM-103作为研究对象,将病毒接种到MA-104细胞和Vero细胞中培养,通过形态学观察、测定病毒滴度等方法,筛选WA株作为优势病毒,确定MA-104细胞为宿主细胞。再将病毒进行浓缩,并且将测定病毒滴度的TCID50技术条件进行优化,与此同时,建立了轮状病毒基因检测的PCR技术,为后续的实验做好准备。接着获取树鼩的原代细胞,将树鼩原代肾细胞、小肠上皮细胞进行培养、纯化,获得处于生长期的细胞再感染病毒,通过测定细胞悬液中病毒的滴度来鉴定病毒感染体外细胞的增殖特性。最后用高滴度的轮状病毒WA株通过灌胃的方式感染树鼩,记录树鼩的体重、体温、以及粪便等级和活动情况,采集树鼩不同时间段的血液、粪便、唾液等样本,同时将严重腹泻的树鼩处死获取体内组织,再用PCR技术和WB方法检测轮状病毒的表达。通过上述方法的建立全文结果如下:1.确定了高毒力和高感染力的WA株病毒和感染之后CPE更为明显的MA-104细胞用于后续实验。同时优化PEG-6000浓缩病毒的方法,获得高毒力、高滴度的轮状病毒WA株作为后续感染实验的材料。使用TCID50测定病毒滴度,通过对比不同条件的病毒滴度,建立了病毒激活的最优条件是胰酶终浓度20ug/ml,孵育时间60min。同时根据轮状病毒WA株感染增殖特性和细胞病变效应,建立轮状病毒RT-PCR检测和验证体系。2.使用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化法和机械振荡联合作用,成功分离获得树鼩原代肾细胞;用胶原酶Ⅺ型和中性蛋白酶I型混合消化液成功获取小肠上皮细胞。所分离出来的树鼩原代肾细胞、小肠上皮细胞贴壁速度快,生长状态好。通过利用树鼩原代细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶敏感度的差异及贴壁时间的不同这两种特点在传代培养过程中对细胞进行纯化,得到了不含杂质细胞的树鼩原代细胞。同时对分离的树鼩原代细胞利用CCK法测定细胞增殖曲线,检测细胞的生长曲线。轮状病毒感染树鼩原代细胞,观察不同时间的细胞病变效应,感染72h原代细胞出现脱落、变圆现象。轮状病毒感染树鼩原代细胞之后,收取细胞悬液,检测细胞悬液中病毒的滴度,验证了轮状病毒WA株可以感染树鼩原代细胞。3.轮状病毒感染树鼩的最佳方式是灌胃,灌胃不同年龄的树鼩选择不同的剂量和毒力的病毒,我们选用每只树鼩灌胃2m L的病毒滴度为1?105.8(TCID50)轮状病毒细胞悬液;感染病毒之后的树鼩,通过生命体征、活动情况、体温、体重、腹泻以及粪便等级等现象初步断定树鼩可以感染轮状病毒WA株,并且各个指标相互佐证,呈现相近规律;通过对感染树鼩的粪便、唾液、血液中轮状病毒的检测,证实轮状病毒在树鼩体内发生复制与增殖,并不简单的只是病毒的排出。我们初步建立了轮状病毒感染树鼩的动物模型,该模型的初步研究对于轮状病毒致病机制和疫苗的研发具有重要的参考意义。