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目的：应用实时荧光定量PCR及RT-PCR方法对兰州地区急性呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物进行HRV/HEV的检测及分型,初步掌握HRV/HEV在兰州地区急性呼吸道感染儿童中的流行特征；探讨不同HRV/HEV基因型与儿童急性呼吸道感染疾病严重程度的关系,掌握其流行特点及规律,揭示和阐明了兰州地区儿童急性呼吸道感染的病因构成及HRV/HEV临床及流行病学特点,并运用单引物扩增技术DNaseI SISPA-PCR扩增获得了5株兰州鼻病毒C群的全基因组,为兰州地区儿童呼吸道感染的防治及进一步的研究奠定了基础。研究对象及方法：1.收集兰州地区2007年12月至2009年11月间,兰州大学第一医院儿科因急性呼吸道感染而就诊或住院的儿童(年龄<18岁)的鼻咽抽吸物(NPAs)和咽拭子标本共计772份,其中2007年12月-2008年11月255份,2008年12月-2009年11月517份。2.收集鼻咽抽吸物和咽拭子标本在登记相关标本采集表后,低温运送至中国CDC病毒所。呼吸道标本经提取核酸后通过Real-time RT-PCR检测HRV/HEV。同时每份标本采用PCR及RT-PCR方法检测了HRSV、IFV(A和B型)、PIV(1、2、3)、HMPV、HCoV (HKU1和NL63型)、AdV、HBoV、WUPyV、KIPyV,并进行了序列测定。随机选取一例HRV阳性标本的Real-time RT-PCR产物经体外转录成RNA标准品,梯度稀释后用以对HRV核酸浓度进行定量。使用基于5-UTR普通RT-PCR和VP4/VP2基因连接区的巢式RT-PCR两个区段,对Real-time RT-PCR阳性标本进行扩增,并对扩增产物进行测序,所得测序结果与美国国立生物技术中心(NCBI) Genebank中的序列进行BLAST比较分析。采用MEGA4.0软件对序列进行分析,并绘制系统进化树。3.选取兰州大学第一医院儿科因急性呼吸道感染而就诊或住院的,经荧光定量PCR和普通RT-PCR检测并分型为鼻病毒C群的阳性的儿童的鼻咽抽吸物标本,经美国国立生物技术中心(NCBI) Genebank中进行BLAST比较分析及MEGA 4.0软件对序列进行分析,并绘制系统进化树后,选取与Genebank中的已发表的病毒株进化关系较远的毒株进行Dnase I-SISPA-PCR扩增,大量随机挑取克隆,并测序后,获得病毒的全基因组。结果：在连续收集的两年的鼻咽抽吸物标本中,共检出HRV/HEV阳性标本205例,总检出率为26.55%。其中HRV检出192例,检出率为24.87%(192／772)；HEV检出13例,检出率为1.68%(13／772)。在HRV阳性的192例阳性标本中,HRV A型共发现112例,检出率为14.6%(112／772)占所有HRV阳性标本的58.3%；HRV B型,14例检出率为1.8%(14／772)占所有HRV阳性标本的7.29%；HRV C型,66例,检出率为8.5%(66／772),占所有HRV阳性标本的34.4%。其中,男性患儿的检出率为27.2%(133／488),女性患儿的检出率为25.4%(72／284),男女感染率之比为1.85：1,男女的感染率无性别差异(P=0.564>0.05)。感染患儿的年龄在6天-13岁10月之间,中位年龄为10月。其中1岁以内患儿115人,检出率为30.1%(115／382)；1-3岁患儿50人,检出率为16.9%(50／295)；3-5岁的患儿27人,检出率为22.5%(27／120)；大于5岁的患儿13人,检出率为17.3%(13／75),分别占了HRV/HEV感染人数的56.1%,24.4%,13.2%和6.3%。HRV/HEV感染患儿最多的诊断为急性支气管肺炎、急性喘息性支气管肺炎、上呼吸道感染和急性支气管炎。在检测的所有阳性标本中36.6%(75／205)的HRV/HEV感染患儿为单独感染；63.4%(130／205)的HRV/HEV感染患儿为混合感染,男女的混合感染率比较无统计学差异(P=0.92>0.05)。在混合感染的RNA病毒中,43.1%(56／130)的患儿混合感染人合胞病毒(HRSV);31.5%(41／130)的患儿混合感染人流感病毒病毒A型(IFVA);27.7%(36／130)的患儿混合感染人副流感病毒3型(PIV 3)；19.2%(25／130)的患儿混合感染人流感病毒B型(IFV B)；0.3%(4／130)的患儿混合感染的人冠状病毒NL63型(HcoV-NL63)；0.2%(4／130)的患儿混合人副流感病毒2型(PIV 2)；0.2%(3／130)的患儿混合感染感染人偏肺病毒(hMPV),在混合感染的DNA病毒方面,13.9%(18／130)的患儿混合感染人博卡病毒(HBoV)；8.5%(11／130)的患儿混合感染人多瘤病毒WU型(WUPyV)；8.5%(11／130)的患儿混合感染人多瘤病毒KI型(KIPyV)；0.4%(5／130)的患儿混合感染人腺病毒(AdV)。人合胞病毒(HRSV)、人流感病毒(IFV)、人副流感病毒(PIV)和人博卡病毒(HBoV)为最常见的混合感染病毒。在合并的细菌感染方面,117分阳性标本做了细菌培养鉴定,其中70例为正常菌群或无菌生长；47例合并有细菌感染,最常见的合并感染的病原菌为肺炎克雷伯杆菌9例；大肠杆菌7例；肺炎链球菌7例；金黄色葡萄球菌7例；流感嗜血杆菌5例；副流感嗜血杆菌4例；阴沟杆菌3例。5’-UTR区段和VP4／VP2基因进化分析发现,所有的标本均能很好的分型,分别为HRV A.HRV B、HRV C和HEV。对HRV A与HRV C组间临床症状进行比较,差别无统计学意义(P>0.05)。结论1.HRV／HEV的检出率较高,在儿童呼吸道感染中占有重要地位,是继呼吸道合胞病毒病毒后的第二位致小儿呼吸道感染的病毒性致病原。2.在临床特点方面的比较HRV C感染与HRV A感染,无明显差别。3.在兰州地区扩增获得的5株鼻病毒C群的全基因组,其中有4株与已有的HRV C全基因组的核苷酸同源性,可认为是HRV C的亚型。