亲和色谱材料的制备及在糖蛋白/糖肽分离分析中的应用研究

来源 :大连理工大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:sturdy13
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糖基化修饰是最常见和最重要的蛋白质翻译后修饰之一,在真核生物中,大约50%的蛋白质发生了糖基化。糖基化参与了多种生命活动,包括细胞生长、发育生物学、细胞内运输、免疫反应和细胞间的交流等。文献报道,异常糖基化和癌症、人类免疫缺陷病毒和免疫失调等疾病的发生发展密切相关,可被应用于诊断和预测疾病及其病理的发展过程,需要发展分离糖蛋白糖肽的新型材料和开发相应的分离分析方法。本论文致力于发展简单、经济和高效的方法制备以硅胶为基质的亲和固定相,并发展相应的色谱分离方法,用于富集和分离糖蛋白/糖肽。针对传统方法中制备亲和固定相所存在的不耐高压和材料亲和容量低的问题,我们改用硅胶为基质,在硅胶表面高效键合亲水性的羧基官能团,经过碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的活化,键合了伴刀豆凝集素(Con A),得到SG Con A色谱固定相。相比较于商品化的以凝胶为基质的凝集素材料Agarose Con A,SG Con A色谱固定相在高效液相色谱模式下,能够高效富集含有复合型聚糖的卵清蛋白(ovalbumin)和含有高甘露糖型聚糖的核糖核酸酶B (RNase B),表现出高效富集糖蛋白糖肽的特点,以及在蛋白质组学分析中的应用潜力。传统的方法制备凝集素材料,存在非特异性吸附的缺点。因此,本文使用氧化葡聚糖为间隔臂,合成了一种以硅胶为基质的Con A材料(SiO2-ODex Con A)用于富集糖蛋白/糖肽。为了比较,我们同时按照传统制备Con A固定相的方法,以环氧丙基硅烷为起始间隔臂,制备了另一种以硅胶为基质的SiO2-Ald Con A材料。相比较于SiO2-Ald Con A材料,SiO2-ODex Con A材料依靠氧化葡聚糖的柔韧性和亲水性的优势,在吸附糖蛋白ovalbumin的过程中展现出较低的非特异性吸附和高结合容量的特点。在高效色谱模式下,SiO2-ODex Con A材料可以高效富集高甘露糖型和双天线复合型聚糖的糖蛋白/糖肽,并且SiO2-ODex Con A材料可以用于从复杂样品中选择性的富集糖蛋白,体现出在蛋白质组学应用中的潜力。目前,针对抗体药物的日益增长需求,发展高效的色谱技术被广泛用于纯化抗体药物。本文依据二乙烯基砜容易发生1,4-Michael addition反应的特点,制备得到二乙烯基砜修饰的阴离子交换模板,并将该共聚物键合在硅胶表面;进一步用于制备得到末端含有亲水性Mannose和(OEG)4NH2基团的硅胶固定相材料(SiO2-DVSM).通过元素分析、固体核磁和红外方法检测了材料表面的物理性质。Zeta电势分析显示了该材料对pH的敏感性,在pH 2.50到8.00之间,我们测定了材料结合IgG的容量。在亲水模式下,SiO2-DVSM材料能够高效分离单糖和多糖,同时在核苷的分离中展现出较好的离子交换性质。通过改变溶液的pH,我们发展了一种混合色谱分离模式,用于分离IgG。经过水(pH 6.0),酸性的水(pH 3.0)和醋酸钠(10 mM,pH 3.2)的洗脱,IgG被分离为四部分,并借助于质谱方法鉴定到各部分的肽段序列。在TCIC模式下,SiO2-DVSM材料成功用于从实际样品人血清中分离IgG,为分离分析IgG提供了一种参考方法。Click反应具有高效快速的优势,被广泛应用于固定相的模板修饰中。但由于微量金属Cu的使用会对生物配基或者待分离的生物分子产生毒性,比如使得凝集素、细胞或者蛋白质等丢失生物活性。本文通过扩环张力引发的叠氮炔环加成(SPAAC)反应,将Protein A分子固定在硅胶表面,制备得到SiO2-SPAAC Protein A材料。在高效液相色谱模式下,SiO2-SPAAC Protein A材料用于富集标准免疫球蛋白IgG,并且可以特异性的从人血清中富集免疫球蛋白。借助于质谱的方法鉴定了所富集得到的聚糖并分析了糖肽的信息,为制备其他类型的生物亲和色谱材料提供了一种参考方法。
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