研究Ⅰ　　伴矿景天中镉的富集和耐受调控机制研究镉是生物毒性最强的重金属之一，经根系吸收后可对植物造成很强的毒害，并可通过食物链传递最终危害人类的健康。因此，阐明镉的吸收、转运及耐性机理，阻断镉向植物体内的迁徙或者培育具有重金属富集能力从而可用于环境治理的超富集植物，无论对于人类健康还是环境保护都具有重要的意义。而天然超积累植物的存在为这些研究提供了绝佳的切入点。伴矿景天(Sedum plumbizincicola)是我国特有的一种镉锌超积累植物。生理分析表明伴矿景天能够耐受高浓度的镉胁迫，并将大部分的镉积累在地上部分的叶片中。亚细胞水平的定位分析表明镉主要积累在伴矿景天的细胞壁中，并以果胶酸盐、蛋白质结合态或吸附态的形式存在，这个结果说明伴矿景天能够有效积累或耐受高浓度镉的主要原因可能包括1）细胞壁的吸附沉积作用;2）通过配位键形成大分子螯合物。　　镉的根部吸收实验表明，伴矿景天主要通过质外体途径吸收镉。伴矿景天与低积累型东南景天的总吸收速率和总吸收量相同，暗示伴矿景天与低积累型东南景天根部的镉吸收系统相似，由此推测根部的镉吸收系统不是导致伴矿景天地上部分超积累镉的主要原因。　　伴矿景天根中细胞质和液泡中的镉含量随着镉处理浓度的增加而降低，而茎叶的细胞质和液泡成分中的镉含量不但低很多，而且并不随镉处理浓度的增加而增加。基因表达分析表明，AtNramp3,AtNramp4基因在伴矿景天中的同源基因Sp1Nramp3在伴矿景天根中的表达量是低积累型东南景天中的3倍，在地上部位则是低积累型东南景天中的10倍。此外，根中伴矿景天HMA同源基因的表达量是低积累型东南景天的40倍。与之相对应的是，伴矿景天木质部/韧皮部伤流液中的镉含量随着镉处理浓度的增加而升高并且远高于低积累型东南景天。这些实验数据表明，伴矿景天可能通过高效的液泡外排机制和木质部装载，促进镉由地下部位向地上长途转运;以及通过地上部位液泡分隔容量的降低，促进镉向质外体空间的分配或者通过韧皮部向其它部位的再分配，从而实现镉在地上部位的超富集以及植物对高镉的耐受能力。　　此外，伴矿景天和低积累型东南景天根中铁含量都随着镉处理浓度的升高而增加，但是在低积累型东南景天中增加更快，并在外界镉浓度为50μM时达到伴矿景天中的4倍。与之相反，低积累型东南景天的锰含量不受镉胁迫处理的影响，而伴矿景天根中锰含量不但低于低积累型东南景天，而且随镉胁迫处理而下降。这些结果预示伴矿景天积累镉的过程可能更主要通过与锰离子转运系统发生互作。　　综上所述，伴矿景天是一种镉锌超积累植物，通过降低液泡分隔容量，增强长途转运和再分配的能力，促使镉运往地上部位并分隔到质外体空间，从而实现伴矿景天适应高重金属的矿井环境。　　研究Ⅱ　　拟南芥AtPCS2基因负调控因子的筛选研究在植物和真菌的重金属解毒机制中，植物螯合肽(PCs)起着重要的作用。植物螯合肽合酶(PCS)的酶活受重金属离子激活并以还原型谷胱甘肽(GSH)为底物合成植物螯合肽。植物螯合肽的一般结构式是（γ-Glu-Cys）n-Gly，其中n的范围在2至11个单位之间。植物螯合肽能与重金属离子螯合，随后PCs-重金属复合物通过跨液泡膜转运分隔到液泡，由此降低细胞质中重金属成分的含量。在拟南芥基因组中有两个基因编码植物螯合肽合酶，分别是AtPCS1和AtPCS2。AtPCS1基因缺失突变体cad1-3对镉高度敏感，其体内也检测不到PCs，暗示AtPCS2不具有PCs合酶活性。但奇怪的是，AtPCS2基因的异位表达不但弥补了裂殖酵母(S.Pombe) pcs-突变株的重金属敏感表型，还回复了PCs的合成表型，而通过启动子置换的方式将AtPCS2基因在拟南芥体内表达，虽然会导致AtPCS2 mRNA表达上调，但是只检测到微弱的AtPCS2蛋白表达，并且仍不能完全弥补cad1-3突变体的镉敏感性状。这些实验事实说明在植物体内可能存在一种未知的调控机制，抑制了AtPCS2的酶活。为了验证这个假设，本研究进行了cad1-3回复突变体的遗传筛选工作。在筛选大约四万株EMS诱变的M2植株的基础上，获得了130株可能的镉耐受幼苗，列这些株系的M3幼苗再次进行根弯曲法检测，获得了4个稳定的镉耐受阳性突变株系。但是在随后进行的图位克隆中发现，这些突变株系都是具有卡那霉素抗性的35S启动子驱动的小麦TaPCS1基因的cad1-3转化子，分析可能是由于TaPCS1转基因植物的种子污染了EMS诱变的M2突变体库。这个结果部分说明AtPCS2的表达调控机制和具体生理作用远较想象中复杂。基于该推测，本研究在总结前期经验的基础上，通过构建CaMV35S启动子驱动的AtPCS2基因编码区与cMyc抗原标签融合的过表达载体，试图回答AtPCS2基因是否真的不能在植物体内表达，或者不能翻译成正常的蛋白质等一些最基本的问题。结果表明，B系列(CaMV35S:: AtPCS2 CDS: cmyc/p1300)和E系列（CaMV35S::AtPCS2CDS:cmyc/pBI121）在cad1-3突变体的异位表达的T1代株系能够检测到AtPCS2蛋白的高量表达，而且A系列(CaMV35S::AtPCS2 CDS/p1300)的T2代能够分离出完全互补cad1-3突变体镉敏感性状的表型。AtPCS2和eYFP的融合蛋白在cad1-3突变体原生质体细胞质有明显表达，而且融合蛋白在洋葱表皮细胞的细胞质和细胞核有明显表达。这些结果提示AtPCS2蛋白的翻译效率可能不是导致在cad1-3中未能检测到PCs的主要原因，而且AtPCS2蛋白可能具有合成PCs以外的生化功能。