细菌L-型是指细菌细胞壁缺陷型,在体内外以及人工诱导情况下均可形成,对作用于细胞壁的抗菌药物耐受。金黄色葡萄球菌可形成L-型,与慢性、反复感染密切相关。目前,关于金黄色葡萄球菌L-型的形成机制尚未明确。本项目从代谢水平探讨了金黄色葡萄球菌细菌L-型的形成机制。目的:1.基于金黄色葡萄球菌Newman株L-型的代谢组学检测结果,探讨L-型形成过程中的代谢变化。2.探究glt B对金黄色葡萄球菌细菌L-型、持留菌和生物被膜形成及细菌毒力的影响。方法:1.制备L-型诱导培养基（LIM）,接种金黄色葡萄球菌Newman株稳定期培养液,诱导建立其不稳定型L-型模型。2.采用PBS冲洗收集在LIM上诱导培养至72h的金黄色葡萄球菌L-型及对照培养基上培养的普通型（N-型）标本,通过非靶向代谢组学测定后,对差异代谢产物进行生物信息学分析。探讨金黄色葡萄球菌L-型的代谢特点,筛选与其形成可能相关的通路。3.将培养至稳定期的金黄色葡萄球菌野生株及glt B基因敲除株（Δglt B）菌液接种LIM并进行诱导培养,观察野生株和Δglt B的L-型形成能力。4.PCR扩增金黄色葡萄球菌Newman株glt B,经过双酶切后与质粒pRAB11连接转化大肠埃希菌DC10B,获得pRAB11-glt B重组质粒,并将pRAB11和pRAB11-glt B分别电转金黄色葡萄球菌野生株和Δglt B,获得WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11和回补株Δglt B::pRABglt B。使用含100ng/m L脱水四环素的TSB诱导培养后收集总RNA,选用q-PCR测定3株菌的glt B表达水平。将3株菌株接种含脱水四环素的TSA平板,培养24h后观察各菌株的生长特性及色素产生能力。5.将WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11和回补株稳定期菌液分别接种含有脱水四环素的LIM,并进行诱导培养,动态观察3株菌株L-型的形成能力和生长速度。6.采用抗生素暴露试验测定WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11和回补株在含脱水四环素的TSB中培养至3h、4h、5h、6h、9h及24h时对氨苄青霉素（20μg/m L）和诺氟沙星（20μg/m L）的敏感性,判断glt B敲除和回补对金黄色葡萄球菌持留菌形成能力的影响。7.采用96孔板将菌株WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11及回补株在含脱水四环素的TSB中培养24h。采用结晶紫染色和OD570nm测定判断glt B敲除和回补对金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力的影响。8.选用BALB/C雌性小鼠,采用腹腔注射法测定金黄色葡萄球菌野生株和突变株Δglt B对小鼠的半数致死量(LD50),判断glt B敲除对细菌毒力的影响。采用q-PCR检测野生株和突变株主要毒力基因hla、hlg A、hlg B、hlg C、luk D、luk E、luk F、luk S、NWMN＿1503、NWMN＿1873、NWMN＿1926、NWMN＿2071、eta、sea的表达状况。结果:1.金黄色葡萄球菌Newman株在LIM上诱导72h后形成了不稳定型L-型,在倒置显微镜下观察,菌落呈典型“油煎蛋”样。2.非靶向代谢组学检测结果显示,诱导培养72h的金黄色葡萄球菌L-型与N-型对照标本比较,共有138种差异性代谢物,其中62种升高,76种下降,表明金黄色葡萄球菌L-型的整体代谢稍活跃。差异性代谢物主要富集于ABC转运系统、氨基酸合成和代谢、核苷酸代谢、双组分系统、碳代谢、氮代谢、氧化磷酸化、谷胱甘肽代谢等通路。3.与金黄色葡萄球菌野生株相比,Δglt B形成L-型的能力明显下降,在诱导培养72h时形成的菌落小、数量少且形态不典型,个别呈“油煎蛋”样,菌落生长速度明显滞后于野生株。4.本研究成功构建了金黄色葡萄球菌WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11和回补株Δglt B::pRABglt B菌株。经脱水四环素诱导后,回补株中glt B基因呈显著高表达。3株菌株在含有脱水四环素的TSA上均可形成S型菌落,但是WT::pRAB11的金黄色色素产生能力显著强于Δglt B::pRAB11和回补株。5.WT::pRAB11和回补株均能在LIM上诱导72h后形成典型的“油煎蛋”样菌落,回补株的菌落数目略少于WT::pRAB11株。Δglt B::pRAB11形成了少量“油煎蛋”样菌落,且其菌落体积小,并可见少量“颗粒型”菌落,表明Δglt B::pRAB11的L-型形成能力显著低于WT::pRAB11和回补株。6.在含脱水四环素的TSB中培养至第3h、4h、5h、6h时,WT::pRAB11、Δglt B::pRAB11及回补株对抗生素氨苄青霉素和诺氟沙星的敏感性未见显著性差异,所有细菌在药物暴露2d后均被杀死。但是Δglt B::pRAB11的9h培养物在氨苄青霉素和诺氟沙星中分别暴露5d和9d均被杀死,而WT::pRAB11分别需要7d和10d才可被全部杀死。Δglt B::pRAB11的24h培养物在氨苄青霉素和诺氟沙星中分别暴露11d和7d均被杀死,而WT::pRAB11的24h培养物在药物作用12d后均仍有大量活菌存在。表明glt B::pRAB11的持留形成能力显著低于WT::pRAB11,回补株回复了对氨苄青霉素和诺氟沙星的持留形成能力。7.在含脱水四环素的TSB中培养24h后观察,WT::pRAB11和回补株的生物被膜形成能力明显强于Δglt B::pRAB11;WT::pRAB11和回补株的OD570nm分别为3.784±0.0173和3.700±0.0164,显著高于Δglt B::pRAB11的2.460±0.1055（P<0.05）。表明Δglt B::pRAB11相较于WT::pRAB11的生物被膜形成能力显著下降。回补株回复了生物被膜的形成能力。8.金黄色葡萄球菌野生株对小鼠的LD50为2.6×109CFU/m L,突变株的LD50为1.065×1010CFU/m L,约为野生株的4.1倍,表明突变株的毒力显著下降。q-PCR测定野生株和突变株的毒力基因表达结果显示,除hlg B外,突变株其余13个毒力基因均呈显著性下调（P<0.05）。结论:1.金黄色葡萄球菌L-型与同期的N-型比较,代谢产物和代谢通路发生了显著改变,代谢水平调整在金黄色葡萄球菌L-型形成及生长过程中发挥重要作用。其中氨基酸代谢和合成（主要包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸合成、谷氨酰胺-谷氨酸代谢等）、碳代谢、ABC转运系统、氮代谢等代谢通路与金黄色葡萄球菌L-型的形成密切相关。2.金黄色葡萄球菌谷氨酸合成酶大亚基基因glt B在其L-型、持留菌、生物被膜形成过程中发挥重要作用,且通过对其主要毒力因子产生的影响调控细菌的毒力。