论文部分内容阅读
雌雄配子体之间的信号交流是被子植物有性生殖的重要环节。这一过程起始于花粉在柱头上黏附并吸水萌发。花粉萌发形成的花粉管首先穿越柱头和花柱道,进入引导组织之后,在来自胚珠的信号的引导下从引导组织穿出,到达胎座表面。最后在胚囊信号的引导下,沿着株柄继续伸长并准确进入珠孔,在助细胞中释放出两个精细胞,完成双受精。在被子植物中,精细胞没有自由移动的能力,需要通过花粉管的运输至胚囊,即管粉受精。运输精细胞的花粉管在快速生长的同时,需要对来自母体组织和雌配子体的信号作出及时响应,以保持正确的生长方向,即花粉管导向。对于花粉管极性生长和导向的调控机制的研究一直是发育生物学领域研究的热点之一。 通过反向遗传学的方法,研究特异地在花粉和花粉管中表达的基因的功能,进而解析花粉管极性生长与导向的分子机制。本研究获得了两个MALE SENSINGFACTOR(MAS)的突变体mas1和mas2。这两个突变体花粉管生长和导向与野生型都没有差异。但在mas1 mas2双突变体中,花粉管的极性生长和导向均存在缺陷。授粉后12h,花粉管在胎座组织表而呈现无序的蜷曲以及加粗和分叉,授粉后24 h,可见多根花粉管靠近珠孔,且此时珠孔附近花粉管呈现分叉表型。此外,用花粉半体外培养系统萌发mas1 mas2花粉管时发现,其长度较野生型短,为同样条件下萌发的野生型花粉管长度的1/2。这些结果表明它们参与了花粉管极性生长的调控。 MAS1蛋白主要定位于生长中的花粉管尖端的质膜上。MAS1的C末端存在钙调蛋白结合结构域(CaMBD),结合实验表明该结构域可以结合CaM2。对CaMBD结构域保守位点进行定点突变,发现突变后的MAS1蛋白不再定位于花粉管质膜,同时无法互补mas1 mas2双突变体表型,说明CaMBD结构域负责MAS1在质膜上的定位,是MAS1正常行使功能所必需。 相较于野生型,在mas1 mas2双突变体花粉管中,[Ca+]cyt含量降低以及Ca2+振荡幅度变小。体外和体内蛋白互作实验结果发现,MAS1与花粉管中的Ca2+通道CNGC18以及参与囊泡转运和融合过程的蛋白VAMP721、VAMP726存在互相作用。在mas1 mas2双突变体中,CNGC18失去了其在花粉管质膜上的定位,而且vamp726突变体存在类似于mas1 mas2的花粉管导向缺陷表型。通过结构域互作验证发现,MAS1的一段Loop区与CNGC18的IQ结构域存在互作,并且CNGC18的C末端一段结构域的存在影响MAS1与CNGC18之间的相互作用。以上结果提示,在花粉管中,MAS1和MAS2参与通过VAMP介导的囊泡融合过程调控CNGC18的质膜定位。 综上所述,本研究发现了在拟南芥花粉管中特异表达的两个质膜蛋白MAS1和MAS2。MAS1定位于快速生长的花粉管尖端质膜上,mas1 mas2双突变体的花粉管生长速度变慢,并呈现对于雌配子体信号的响应紊乱。通过对其蛋白功能的初步探讨发现,MAS蛋白可能通过调控花粉管内的Ca2+平衡及调控VAMP介导的囊泡与靶膜融合的过程,进而影响CNGC18或者其它功能蛋白的在质膜上的定位,从而调控植物花粉管的极性生长和导向。