【摘 要】
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目的:使用全蛋白TMT标记定量蛋白质组学分析LN患者和健康对照组（Normal Control,NC）的血液、尿液外泌体中的差异蛋白质,试图进一步寻找LN新型诊断生物标记物。方法:使用试剂盒方法提取LN和NC的血清、尿液外泌体,通过电镜、粒径、Western Blot对外泌体表征进行鉴定,对所提取的外泌体进行蛋白质提取、肽段酶解、TMT标记、色谱分级、LC-MS/MS数据采集、数据库检索等。以FC
【基金项目】
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国家自然科学基金（81860296）:linc0597/miR-92a介导Fractalkine调控Th17/Treg细胞在系统性红斑狼疮发病中的作用及其机制研究； 右江民族医学院研究生创新计划项目（YZCXJH2020003）:基于外泌体全蛋白TMT标记定量蛋白质组学筛选狼疮性肾炎尿液生物学标记物；
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目的:使用全蛋白TMT标记定量蛋白质组学分析LN患者和健康对照组（Normal Control,NC）的血液、尿液外泌体中的差异蛋白质,试图进一步寻找LN新型诊断生物标记物。方法:使用试剂盒方法提取LN和NC的血清、尿液外泌体,通过电镜、粒径、Western Blot对外泌体表征进行鉴定,对所提取的外泌体进行蛋白质提取、肽段酶解、TMT标记、色谱分级、LC-MS/MS数据采集、数据库检索等。以FC>1.2倍且P<0.05为标准筛选显著差异性蛋白,得到LN与NC血清、尿液各比较组间的上调和下调蛋白质数目,随后对所得出的显著差异蛋白进行生物信息学分析,分析内容主要包括鉴定分析、表达差异分析、功能分析等。收集LN患者临床资料及实验室检查:如性别、年龄、病程、有无发热、蝶形红斑、光过敏、脱发、粘膜溃疡、关节炎、浆膜炎、脉管炎、有无脑血管意外、神经系统异常、血常规,尿常规,血肌酐,24小时尿蛋白定量,血清白蛋白,补体C3,补体C4,自身免疫抗体（抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体、抗SSA/Ro60KD抗体、抗SSA/Ro52KD抗体等）。使用SPSS 25.0统计学分析软件对所得实验及临床数据进行统计分析,所有数据均进行正态分布分析。正态分布数据两组间比较采用两组独立样本t检验,非正态分布数据采用秩和检验进行比较;正态分布数据两组间相关性分析使用Pearson相关系数分析,偏态分布数据两组间相关性分析使用Spearman秩相关系数分析,二分类资料相关性则用logistic回归性分析,所有统计学分析均为双侧,P<0.05认为差异有统计学意义。结果:（1）电镜的结果显示外泌体呈球形的囊泡,大小均一,形态完整;粒径-NTA检测结果显示外泌体的直径为30-200 nm;Western-blot蛋白验证显示LN组外泌体CD63、TSG101阳性。（2）血清外泌体中共鉴定到677个蛋白质,可定量的有672个,差异倍数（Fold Change,FC）>1.2倍且P<0.05为标准,得出比较组中106个显著差异蛋白,基于上述数据,对显著差异蛋白质进行亚细胞器定位,大部分蛋白质主要分布在细胞外、细胞骨架、细胞核、细胞质膜;在GO分析中,在细胞成分上,血清外泌体差异蛋白质主要集中在细胞外基质、基底层、血小板致密颗粒腔等成分上;在分子功能上,血清外泌体差异蛋白质主要集中离子通道抑制剂活性、通道调节器活动、抗原结合等功能上;在生物过程中,血清外泌体差异蛋白质主要参与受体介导的内吞作用、蛋白质活化级联、体液免疫反应的负调节等过程。KEGG信号通路分析显示,血清外泌体差异蛋白质主要参与哮喘病、产生Ig A的肠道免疫网络、磷脂酶D信号通路、类风湿性关节炎等通路.尿液外泌体中共鉴定出3414个蛋白质,可定量的有3355个,以FC>1.2倍且P<0.05为标准,得出比较组中157个显著差异蛋白,基于上述数据,对显著差异蛋白质进行亚细胞器定位,大部分蛋白质主要分布在细胞外、细胞质、细胞核;在GO分析中,在细胞成分上,尿液外泌体差异蛋白质主要在细胞外区、细胞外间隙、细胞外囊泡等成分上;在分子功能上,尿液外泌体差异蛋白质主要在肽酶调节器活性、免疫球蛋白受体结合、丝氨酸型内肽酶抑制剂的活性等功能上;在生物进程中,尿液外泌体差异蛋白质主要参与免疫反应、蛋白质定位到端粒的建立的正向调节、调控蛋白质在染色体上定位等过程。KEGG信号通路分析显示,尿液外泌体差异蛋白质主要参与溶酶体、PI3K-Akt信号通路、紧密连接、致病性大肠杆菌感染、细胞凋亡等通路。（3）进一步分析LN患者血清外泌体SVEP1、PCSK9蛋白表达水平与实验室指标相关性,结果表明,LN患者血清外泌体SVEP1表达量与肾小球滤过率呈负相关（r=-0.738,P=0.023）;LN患者尿液外泌体蛋白ENG、GOT1表达水平与实验室指标相关性,结果表明,LN患者尿液外泌体中ENG的表达量与C3（r=-0.8,P=0.01）、C4（r=-0.745,P=0.021）水平呈显著负相关。在血清组SVEP1、PCSK9蛋白表达水平差异性分析,ds-DNA抗体阳性组PCSK9表达量显著低于阴性组（P<0.05）;在尿液组ENG、GOT1蛋白表达水平差异性分析,C3、C4降低组ENG表达量显著高于不降低组（P<0.05）。结论:利用LC-MS/MS质谱蛋白组学分别分析血清组及尿液组两组外泌体中的蛋白质组学,通过鉴定LN患者和健康对照组的血清及尿液外泌体蛋白的表达差异性,血清组共筛选出106个显著差异蛋白,尿液组共筛选出157个显著差异蛋白,两组共有13个共同表达蛋白。根据差异性分析、LN患者实验室检查相关性分析及结合相关文献报道,我们发现与炎症反应相关的SVEP1、ENG、PCSK9、GOT1可以作为LN诊断生物标记物,且有评估LN疾病活动的生物标记物的潜力。下一步有必要对这些生物标记物进行大样本的验证,且研究其在LN发病机制及在诊断、疗效及预后判断中的价值具有重要的科学意义。
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