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牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)又名牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus-1,BHV-1)感染症,是一种急性、热性、接触性传染病,给全球养牛业造成了巨大的经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为B类疾病,属我国进境动物和国际动物贸易重点检疫的对象。迄今为止,国内外已建立了多种用于IBR检测的方法,国际贸易中OIE推荐使用ELISA和中和试验方法。为了满足出入境检疫的需要及IBR的监控,本研究克隆了BHV-1的gB、gE基因,构建了gB、gE的原核、真核表达载体,获得了gB的原核高效表达,建立了检测BHV-1的间接ELISA方法。首先,对BHV-1的gB、gE蛋白进行抗原性分析,根据其免疫原性和载体的要求设计多对引物。采用PCR方法,从牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株的MDBK细胞培养物中扩增gB、gE基因全长编码区序列并将其克隆至pGEM-Teasy载体。以重组质粒pGEM-T-gB、pGEM-T-gE为模板,PCR扩增gB、gE基因片段,将其分别插入原核表达载体pET-32a中,并构建了以BL21(DE3)为宿主菌株的原核表达系统。通过探索IPTG诱导浓度、诱导温度、菌体收获时间等条件,确定了编码gB 28～216 aa、gB 236～418 aa和gB 384～639 aa的DNA序列gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ能在pET-32a/BL21(DE3)中表达,表达的重组蛋白主要为包涵体。采用磁化组氨酸蛋白纯化系统、电洗脱和超声波裂解配以曲通-尿素对包涵体进行洗涤三种方法纯化融合重组蛋白,取得较好的效果。Western-Blot和ELISA检测结果表明,纯化的pET-gBⅠ、pET-gBⅡ和pET-gBⅢ重组融合蛋白与BHV-1标准阳性血清呈现良好的反应性,重组蛋白pET-gBⅢ的反应原性最好。其次,为了得到可溶性的重组gB、gE蛋白,以重组质粒pGEM-T-gB和pGEM-T-gE为模板分别扩增gB、gE部分基因片段, PCR产物纯化后经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的