肺癌是一种最常见的恶性肿瘤，其中，小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)占原发肺癌的15％～25％，其倍增时间短、生长快，很早就发生全身转移。90％的SCLC患者首选放疗和化疗。虽然对放、化疗敏感，但SCLC是近30年来所有治疗敏感的肿瘤中最容易复发、预后最差的一种。有鉴于此，在放、化疗的基础上，寻找更有效的药物作为一种辅助治疗手段对SCLC的治疗有重要意义。　　 近年来，非神经元性胆碱能信号通路与肿瘤的关系受到广泛关注。发现肿瘤细胞能够自分泌或旁分泌乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)，作用于自身或邻近细胞上的烟碱型胆碱受体(nicotinic cholinergic receptors，NRs)和毒蕈碱型胆碱受体(muscarinic cholinergic receptors，MRs)，调节肿瘤的生长、转移等。MRs有5个亚型(M1R～M5R)，研究发现在乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌等都有MRs的表达，而且MRs拮抗剂能够抑制肿瘤细胞增殖、血管发生、细胞迁移并增加凋亡等，其中尤以M3R为重要。但有关M3R和SCLC的研究报道不多，M3R在SCLC细胞增殖中作用的研究结果还不一致，M3R在SCLC其他方面如肿瘤细胞黏附、迁移及侵袭中的作用尚未见报道。　　 M3R拮抗剂在临床上治疗慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonarydisease，COPD)已经很长时间，具有很好的安全性和疗效。如果在体外证实了SCLC细胞株表达M3R且M3R拮抗剂能够抑制SCLC细胞增殖、迁移、侵袭和黏附等，将为进一步研究M3R拮抗剂作为SCLC辅助治疗的一种手段提供试验和理论依据，也许能够为SCLC尤其是同时合并COPD患者的治疗带来新的希望。基于上述考虑，我们做了如下的研究。　　 第一章、体外人小细胞肺癌细胞株的培养　　 目的：体外培养人SCLC细胞株SBC3和H82并观察其生长特性，以备后续试验所用。　　 方法：体外培养SBC3和H82细胞，采用cell counting kit-8试剂盒检测细胞生长曲线，MycoAlert支原体检测试剂盒监测所培养细胞有无支原体污染。　　 结果：SBC3和H82细胞传代后经过大概24h潜伏期，至48h及72h进入大量分裂的对数生长期。大概96h，细胞达到饱和密度后，生长缓慢并停止，进入平台期，然后退化衰亡(图2)。SBC3和H82细胞培养不同时间平均吸光度(opticaldensity，OD)值见表1。试验所用人SCLC细胞株SBC3和H82没有支原体的污染。　　 结论：SBC3和H82体外培养生长良好，此研究所培养的肿瘤细胞SBC3和H82细胞没有被支原体污染，培养至48h及72h进入对数生长期，是行M3R受体检测及功能试验的最佳时间。　　 第二章、毒蕈碱胆碱受体3在小细胞肺癌中的表达　　 目的：明确SCLC细胞株SBC3和H82是否表达M3R，以进一步行M3R在SCLC中功能的研究。　　 方法：体外培养人SCLC细胞株SBC3和H82，采用RT-PCR及Western blotting法检测细胞M3R mRNA及蛋白的表达。　　 结果：如图3、图4所示，SBC3和H82细胞均有特异性M3RmRNA和蛋白的表达。SBC3细胞M3R mRNA的表达强于H82细胞，以β-actin标化后的SBC3细胞M3R蛋白表达强度为H82细胞的2.65倍(P＜0.01)。　　 结论：人SCLC细胞株SBC3和H82表达M3R，M3R表达水平在两细胞株间存在差异。SBC3细胞株M3R表达明显强于H82，故选择SBC3细胞株进一步研究M3R在SCLC中的功能。　　 第三章、毒蕈碱胆碱受体3在小细胞肺癌中的功能研究　　 第一节 毒蕈碱胆碱受体3在小细胞肺癌增殖中的作用　　 目的：研究M3R在SCLC细胞增殖中的作用。　　 方法：体外培养人SCLC细胞株SBC3，采用MTT比色法研究胆碱受体激动剂碘化乙酰胆碱(acetycholine iodide，Ach)及选择性M3R拮抗剂4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine methiodide(4-DAMP)对细胞增殖的影响。试验分组如下：①正常对照组；②不同浓度Ach组(10-6、10-5、10-4、10-3M)；③Ach(10-4M)+不同浓度4-DAMP组(10-8、10-7、10-6、10-5M)；④不同浓度4-DAMP组(10-8、10-7、10-6、10-5M)。分别于0、24、48、72h通过检测550 nm/650nm OD值判定各组中活细胞数量。　　 结论:外源性Ach浓度依赖性地刺激SCLC增殖，M3R拮抗剂能够阻断Ach的作用。无外源性Ach的条件下，M3R拮抗剂亦能够抑制SCLC的增殖。　　 第二节 毒蕈碱胆碱受体3在小细胞肺癌迁移、侵袭中的作用　　 目的:研究M3R对SCLC细胞迁移的影响及M3R在基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase，MMP-2和MMP-9)诱导的细胞侵袭中的作用。　　 方法:体外培养人SCLC细胞株SBC3，采用Boyden侵袭小室法研究胆碱受体激动剂Ach及选择性M3R拮抗剂4-DAMP对细胞迁移的作用。试验分组如下：①不同浓度Ach组(10-7、10-6、10-5和10-4M)；②不同浓度4-DAMP(10-7、10-6、10-5M)+10-4M Ach组。显微镜下计数5个高倍视野(400×)细胞数求平均值后记做迁移细胞数。采用明胶酶谱法分析测定不同浓度Ach(10-6、10-5、10-4M)对SBC3细胞MMP-2和MMP-9表达水平的影响，试验分组如下：①VA13细胞培养液为阳性对照；②RPMI-1640尤血清培养液为阴性对照；③不同浓度Ach(10-6、10-5、10-4M)作用后的SBC3细胞培养液。　　 结论:Ach刺激SCLC向Fn的迁移，M3R拮抗剂阻断Ach的作用。各浓度Ach不影响SBC3细胞MMP-2和MMP-9的表达，M3R在MMP-2和MMP-9诱导的SBC3细胞侵袭中可能没有作用。　　 第三节 毒蕈碱胆碱受体3在小细胞肺癌黏附中的作用　　 目的:研究M3R在SCLC黏附中的作用及其影响机制。　　 方法:体外培养人SCLC细胞株SBC3，采用流式细胞法检测整合素的表达，相同方法观察胆碱受体激动剂Ach和选择性M3R拮抗剂4-DAMP对SBC3细胞所表达的整合素的影响。Ach、4-DAMP及整合素抗体对SBC3细胞黏附的作用用人Fn包被的96孔板来研究。牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和Fn包被的孔中加入未经药物处理的细胞分别作为阴性和阳性对照，Fn包被孔加入不同药物处理的细胞的试验分组如下：①10-4M Ach+10-5M4-DAMP；②10-4MAch+5μg/ml抗人αv整合素抗体；③10-4M Ach+5μg/ml抗人α5整合素抗体；④10-4M Ach+5μg/ml抗人αv和α5整合素抗体；⑤10-4M Ach+5μg/ml抗人β1整合素抗体；⑥10-4MAch。显微镜下计数5个高倍视野(200×)细胞数求平均值记做黏附细胞数。　　 结论:M3R拮抗剂抑制体外SCLC的黏附，这种作用是通过抑制细胞表面含β1的整合素(αvβ1和α5β1)的功能实现的，而不能改变整合素的表达水平。　　 本研究得到下列结论：　　 1.人SCLC细胞株SBC3和H82均表达M3R，M3R可能为SCLC治疗潜在的新的靶点。　　 2.外源性Ach浓度依赖性地刺激SCLC细胞增殖，M3R拮抗剂能够阻断Ach刺激的细胞增殖。　　 3.在没有外源性Ach的情况下，M3R拮抗剂亦可以阻断SCLC细胞增殖，说明SCLC能够自分泌内源性Ach，Ach做为一种生长因子通过作用于M3R，刺激细胞的增殖。　　 4.外源性Ach浓度依赖性地刺激SCLC细胞的迁移，M3R拮抗剂阻断Ach的作用，说明在体外M3R拮抗剂能够抑制SCLC的迁移。　　 5.M3R在MMP-2、MMP-9诱导的SCLC细胞侵袭中没有作用。　　 6.M3R拮抗剂能够抑制SCLC细胞黏附，这种作用是通过抑制含β1(αvβ1和α5β1)整合素的功能实现的，而对细胞表面整合素的表达水平没有影响。　　 综上所述，M3R功能的阻断，可抑制SCLC细胞的增殖、迁移和粘附，M3R可能为SCLC治疗潜在的新的靶点。M3R拈抗剂对SCLC的作用需做进一步的试验和临床研究。