论文部分内容阅读
目的:肥胖是2型糖尿病的重要危险因素,血管并发症是2型糖尿病致死致残的主要原因。肥胖时脂肪组织快速增大,先于血管新生的速度,以及脂肪细胞肥大等原因导致脂肪组织局部缺氧,并伴有炎性巨噬细胞浸润,表现为胰岛素抵抗和慢性低度炎症,合成分泌TNF-α和MCP-1等促炎细胞因子和游离脂肪酸增多,而抗炎因子如脂联素等减少,影响肝脏和骨骼肌中的胰岛素作用,导致全身胰岛素抵抗,继而诱发2型糖尿病,并可进一步诱发内皮细胞胰岛素抵抗和功能障碍,导致心血管疾病。内皮功能障碍是心血管病的病理生理基础,改善内皮功能有助于防治心血管疾病。此外,运动可以增加内皮依赖性血管舒张,改善胰岛素抵抗和内皮功能。运动还刺激肌肉组织分泌多种细胞因子和特异性肌肉因子,可能在运动改善胰岛素抵抗和内皮功能中发挥作用,但其详细的机制尚不明确。本研究用电脉冲刺激骨骼肌细胞收缩模拟肌肉收缩,提取骨骼肌细胞条件培养基,探讨收缩的骨骼肌细胞条件培养基对内皮细胞胰岛素抵抗和功能障碍的作用。内容:第一部分,检测收缩的骨骼肌细胞条件培养基对内皮细胞炎症和凋亡的作用。用缺氧培养的脂肪细胞条件培养基诱导内皮细胞炎症反应,再用收缩的骨骼肌细胞条件培养基与脂肪细胞条件培养基共培养内皮细胞,检测巨噬细胞的迁移,内皮细胞E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-6的mRNA表达,内皮细胞细胞IKKα/β和NF-κB的磷酸化,SOCS3蛋白水平和内皮细胞的凋亡。第二部分,探索收缩的骨骼肌细胞条件培养基在改善内皮细胞胰岛素抵抗和功能障碍中的作用。用缺氧培养的脂肪细胞条件培养基诱发内皮细胞胰岛素抵抗和功能障碍,再用收缩的骨骼肌细胞条件培养基与脂肪细胞条件培养基共培养内皮细胞,检测内皮细胞Akt和eNOS的磷酸化,内皮细胞NO水平。单独使用收缩的骨骼肌细胞条件培养基刺激内皮细胞,检测内皮细胞AMPK和eNOS磷酸化随时间的变化趋势。用缺氧的脂肪细胞条件培养基造成内皮细胞功能障碍,再用收缩的骨骼肌细胞条件培养基在最佳刺激时间刺激内皮细胞,并用AMPK抑制剂Compound C抑制AMPK磷酸化,检测内皮细胞AMPK和eNOS磷酸化。方法:分别在常氧和缺氧条件下培养脂肪细胞16h,提取上清液作为脂肪细胞条件培养基(CM-N和CM-H),电脉冲刺激骨骼肌细胞12h,提取上清作为骨骼肌细胞条件培养基(CM-EPS),用CM-N或CM-H与CM-EPS共培养内皮细胞,Transwell检测巨噬细胞迁移,Real-time PCR检测内皮细胞E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-6 mRNA表达,Western blot检测内皮细胞细胞IKKα/β、NF-κB、Akt和eNOS的磷酸化和SOCS3蛋白水平,试剂盒测定内皮细胞NO生成,流式细胞术检测内皮细胞凋亡。用CM-EPS培养内皮细胞不同时间,Western blot检测内皮细胞AMPK和eNOS的磷酸化。分别用CM-N和CM-H培养内皮细胞16h后,用CM-EPS刺激内皮细胞并通过Compound C抑制AMPK,Western blot检测内皮细胞AMPK和eNOS磷酸化。结果:第一部分结果显示,CM-EPS显著降低了CM-H诱发的内皮细胞招募巨噬细胞的作用、内皮细胞E-selectin、ICAM-1、MCP-1和IL-6 mRNA水平,IKKα/β、NF-κB的磷酸化、SOCS3蛋白水平以及内皮细胞凋亡。第二部分结果显示,CM-EPS逆转了CM-H抑制内皮细胞Akt和eNOS磷酸化的作用,增加了内皮细胞NO生成。CM-EPS刺激内皮细胞AMPK和eNOS的磷酸化,在1h时达最大值,AMPK抑制剂Compound C抑制此作用。结论:1、CM-EPS显著降低了CM-H诱发的内皮细胞招募巨噬细胞的作用,并降低了内皮细胞E-selectin、ICAM-1和MCP-1的mRNA表达。2、CM-EPS显著降低CM-H诱导的内皮细胞IL-6的mRNA水平、IKKα/β和NF-κB的磷酸化、SOCS3蛋白水平,以及内皮细胞的凋亡。3、CM-EPS显著改善了CM-H诱发的内皮细胞胰岛素抵抗和内皮功能障碍。4、CM-EPS通过磷酸化内皮细胞AMPK改善内皮功能。综上所述,电脉冲刺激收缩的骨骼肌细胞条件培养基逆转了缺氧脂肪细胞条件培养基造成的内皮细胞炎症反应、细胞凋亡、胰岛素抵抗和内皮功能障碍。