瘦素、胰岛素及IGF-2对滋养细胞中PKB和P<'70>S6K蛋白表达的影响及信号传导途径

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目的出生体重与成年疾病密切相关,大量研究表明影响出生体重的因素主要包括:营养因素、胎盘的结构和功能、生长因子以及激素。其中影响出生体重的多种生长因子和激素中最有代表性的是瘦素、胰岛素及胰岛素样生长因子-2(IGF-2)。但它们影响出生体重的信号通路仍不十分明确。越来越多的研究发现PI3K/PKB/mTOR信号传导通路可通过调节其下游P70S6K蛋白的表达和活性,调节滋养细胞的生长和分化。本研究通过瘦素、胰岛素及IGF-2对滋养细胞中PKB和P70S6K蛋白表达的影响,以及这一信号通路中PI3K的特异性抑制剂LY294002和mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin)对PKB和P70S6K蛋白表达的调节作用,探讨瘦素、胰岛素及IGF-2对出生体重的影响是否同PI3K/PKB/mTOR信号途径存在联系。材料与方法正常妊娠妇女进行人工流产手术时获取的绒毛组织,用0.25%胰酶4℃消化约40min。离心后加入25IU/ml DNaseⅠ作用10~15min。100目滤网过滤,用2.5%和1.25%的BSA密度梯度沉降45min,收集下层滋养细胞离心后接种于预先涂有Ⅰ型胶原的培养皿中。37℃含5%CO2湿度为99%的孵箱中培养。根据细胞生长情况2~3d换液一次。取生长状态较好的滋养细胞血清饥饿24小时后换成含10%胎牛血清的DMEM培养液,分别给与瘦素10nmo/L;胰岛素6nmol/L;IGF-2 25nmol/L作用24小时。另一组同时分别加入LY294002 20umol/L;rapamycin 100nmol/L作用24小时后收集细胞(5-6×106)备用。将收集的细胞按凯基全蛋白提取试剂盒步骤加提取液。考马斯亮蓝法蛋白定量,应用Western blot技术检测瘦素、胰岛素及IGF-2作用后滋养细胞中PKB和P70S6K的蛋白表达情况,以及LY294002和rapamycin对蛋白表达的影响。结果用gene tools from syngene凝胶图象分析系统分析。资料以均数±标准差((?)±s)表示,结果采用SPSS13.0统计软件进行ANOVA检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、瘦素、胰岛素及IGF-2刺激组滋养细胞中PKB和p70S6K蛋白的表达同对照组相比明显增加(均P<0.05)。2、瘦素、胰岛素及IGF-2刺激组分别加入LY294002和rapamycin,PKB和p70S6K蛋白的表达均明显降低(均P<0.05)。结论1、瘦素、胰岛素及IGF-2可促进滋养细胞中PKB和p70S6K蛋白的表达,并且这种作用可被PI3K/PKB/mTOR信号传导通路的特异性抑制剂LY294002和rapamycin所抑制。2、瘦素、胰岛素及IGF-2对出生体重的影响可能部分是通过PI3K/PKB/mTOR信号通路实现的。
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