猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种危害养猪业的传染病,临床上主要表现为妊娠母猪的繁殖障碍和断奶仔猪的呼吸道症状。1987年美国首次发现该病,1996年郭宝清、陈章水等人证实我国猪群存在PRRSV感染。目前,该病已遍及世界的主要养猪国家和地区,对养殖业造成了巨大的经济损失。热休克蛋白(heat shock proteins, Hsp-s)是一种在热休克、病原微生物感染等应激条件下,细胞产生的对自身起保护作用的蛋白质。Hsp-s是一种高度保守的蛋白质家族,广泛存在于真核生物和原核生物中。作为伴侣分子,Hsp-s主要参与蛋白质的正确折叠、转运以及促使未正确折叠蛋白质的降解,从而参与细胞信号转导、免疫应答、生物进化等。按照分子量大小,分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小Hsp家族。Hsp90在细胞内蛋白质构象的成熟中起重要作用,并且又是许多病毒蛋白合成的重要伴侣分子。为了阐明Hsp90在PRRSV复制过程中所扮演的角色,进行了以下研究：1.PRRSV感染促使Hsp90p的变化用PRRSV WUH3株分别感染Marc-145细胞和PAM细胞,通过相对荧光定量PCR和Western Blotting,检测Hsp90p在nRNA水平和蛋白表达水平上的变化,发现PRRSV在两种细胞中均能引起Hsp90β表达的上调。2.Hsp90特异性抑制剂17-AAG对PRRSV增殖的影响根据17-AAG对Marc-145细胞的毒性实验结果,以及17-AAG对PRRSV增殖的抑制效果,选用17-AAG终浓度为51μM作为后续实验的使用浓度。在病毒复制早期的不同时间点加入17-AAG,发现抑制剂均能显著抑制PRRSV的增殖和Nsp2的表达,并且以PRRSV感染早期加入17-AAG的抑制效果最显著,说明抑制剂主要是在PRRSV复制的早期起作用。此外,PRRSV WUH3株感染Marc-145细胞,17-AAG处理后,通过蚀斑实验和Western Blotting实验,发现17-AAG在12h、24h、36h、48h均对PRRSV的增殖有抑制作用,并且显著抑制Nsp2的表达。3.Hsp90干扰分子对PRRSV增殖的影响为了从正面证实Hsp90在PRRSV增殖中的作用,设计合成针对猴源Hsp90β和猪源Hsp90的干扰分子,通过Western Blotting和相对荧光定量PCR实验证实设计的干扰分子能有效抑制相应基因的表达。然后,将各干扰分子分别转染Marc-145细胞和PAM细胞,PRRSV感染后,通过蚀斑实验和Western Blotting检测发现干扰Hsp90后均能抑制PRRSV的增殖和Nsp2的表达。4.17-AAG对PRRSV非结构蛋白表达的影响Nsp2具有半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinse, CP2)活性,介导Nsp2/Nsp3切割,并且Nsp2和Nsp3均是PRRSV复制和转录的必需蛋白；而Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶,并与非结构蛋白Nsp10、Nsp11、Nsp12共同形成复制酶复合体(Replicase Complex),负责动脉炎病毒基因组的复制及亚基因组的转录。为了研究17-AAG对PRRSV非结构蛋白表达的影响,将Nsp2、Nsp3、Nsp9、Nsp12分别连接到真核表达载体pCAGGS-HA上,构建了真核表达质粒,瞬时转染Marc-145细胞,Western Blotting检测17-AAG对非结构蛋白表达的影响,结果表明抑制剂能够显著抑制Nsp2的表达,而对Nsp3、Nsp9和Nsp12的影响不显著。5.17-AAG对NF-κB信号通路的影响NF-κB信号通路在PRRSV复制过程中发挥重要作用,在证实17-AAG能够抑制PRRSV增殖的基础上,通过双荧光素酶报告系统检测发现PRRSV能够激活NF-κB,而17-AAG则抑制PRRSV诱导的NF-κB激活。