前言：　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。目前研究发现间充质干细胞不仅具有多向分化、支持体外造血重建的功能，还有低免疫原性和独特的免疫调节特性。现已证实，体外培养扩增的MSCs对各种免疫细胞均有免疫调节作用，而且这种作用是不受MHC(majorhistocompatibility complex)限制的。低免疫原性在同种异体移植中具有重要意义，而免疫调节作用，则为免疫排斥反应的治疗带来了新的希望。有研究表明，将MSCs与异基因造血干细胞(haemopoietie stem cell，HSC)共输入，可以有效地减弱移植后的免疫排斥反应。目前实验及临床研究所用的MSCs的主要来源是骨髓。另外，MSCs也可来源于脂肪、骨、肌肉、软骨、肺脏、韧带等。但由于数量有限，且对供者有一定的损伤，使其研究和应用受到限制。为此，很有必要寻找新的MSCs来源。　　近年来有文献报道，从胎儿出生后多作为废物丢弃的胎盘中，可分离出一种成纤维细胞样细胞，它可能含有与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)相似的特性。由于胎盘来源方便，对供者无损伤，且富含间充质，如能分离出MSCs，将提供丰富的细胞来源。而目前，关于胎盘中是否含有丰富的间充质干细胞以及该细胞是否具有BMSCs相似的免疫调节作用，国内的相关研究报道很少。　　一直以来，免疫抑制药物在免疫排斥反应的预防及治疗中起着极为重要的作用。但是由于它们的毒副作用强，应用有一定的限制性。能否利用MSCs的免疫调节特性，将MSCs与免疫抑制药物联合应用于免疫排斥反应的治疗，在保证治疗效果的前提下减少长期应用药物带来的毒副作用，是个令人感兴趣的问题。但是目前此类研究的报道很少。因此，在将它们联合应用于患者前，我们需要了解它们之间的相互作用。　　本实验尝试从人胎盘中分离提取间充质样干细胞(human placenta derivedmesenchymal-like stem cells PDMSCs)，对其细胞表型，增殖、分化等生物特性进行初步了解。并将人胎盘MSCs与异基因T淋巴细胞共培养，经PHA刺激后，通过T细胞增殖的情况来测定PDMSCs对异基因T淋巴细胞的免疫调节作用，进而通过检测T细胞在细胞周期、早期活化标志、细胞因子的分泌、细胞亚群等方面的改变，来初步探讨PDMSCs发挥免疫调节作用的可能机制。　　我们还将PDMSCs与免疫抑制药物环孢素A(CsA)/霉酚酸(MPA)联合，在体外作用于单向淋巴细胞混合反应，通过检测对淋巴细胞增殖情况的影响来初步判断二者在异体免疫反应中的相互作用。通过这些研究，我们期望能更加深入的了解胎盘来源间充质干细胞的生物学特性及免疫学特性，为其在临床上与免疫抑制药物的联合应用，从而预防和治疗免疫排斥反应提供充足的实验依据。　　第一部分人胎盘来源间充质千细胞的分离、培养及生物学特性的研究　　目的:从胎盘中分离提取间充质样干细胞，并对其细胞表型、增殖、分化等生物特性进行初步了解。　　方法:组织块培养法进行PDMSCs的分离及原代培养，传代后进行形态观察，细胞计数法绘制PDMSCs的生长曲线，流式细胞技术检测PDMSCs表型。PDMSCs向软骨细胞及内皮细胞诱导，光镜下观察诱导后细胞形态，并用甲苯胺蓝染色及免疫细胞化学染色法检测向软骨细胞诱导后糖胺多糖及Ⅱ型胶原的表达情况。免疫细胞化学染色法检测向内皮细胞诱导后vWF的蛋白表达情况。　　结果:胎盘小块培养14d后有少量长梭形细胞爬出，约25d铺满培养皿70-80％，细胞呈漩涡状生长，胞体细长似成纤维细胞。传代后增殖速度明显加快，约6d可铺满培养皿底80％，细胞排列整齐，形态均一，连续15代后，细胞仍能维持增殖能力和典型的成纤维样形态学特征。传代细胞经过约48h潜伏期后，进入一个3-5天的对数生长期，随后是一个较长的缓慢增长期。平均倍增时间约为38h。经流式细胞仪检测PDMSCs均一表达CD29，CD44，而不表达CD31，CD34,CD45，HLA-DR。PDMSCs向软骨细胞诱导7d后，由梭形逐渐向多角形多边形转变，并有多处凸起，诱导14d后，甲苯胺蓝染色及免疫细胞化学染色均呈阳性。PDMSCs向内皮细胞诱导4d后，少量细胞核呈椭圆形，胞体变小呈卵圆形，形态饱满，立体感强。第8d-12d，细胞60％-90％汇合，胞体变小呈鹅卵石样。细胞首尾紧密连接，呈管腔状、轮辐状、条带状生长。诱导后4d胞浆和胞核开始表达vWF。　　结论:本研究成功地从人胎盘组织中分离培养出间充质干细胞PDMSCs，并证明PDMSCs有较强的增殖能力，具有与骨髓间充质干细胞相似的形态结构及细胞表型，并可在一定条件下诱导表达软骨细胞及内皮细胞的标志，提示PDMSCs有多向分化潜能。　　第二部分人胎盘间充质干细胞对异基因T淋巴细胞增殖的影响及其机制的探讨　　目的:研究PDMSCs对共培养后异基因T淋巴细胞的影响，探讨PDMSCs发挥免疫调节作用的方式及可能机制。　　方法:将PDMSCs与PHA激活的外周血T淋巴细胞共培养，MTT法检测T细胞增殖情况，流式细胞术检测T细胞的周期，早期活化标志CD25、CD69的表达情况，AnnexinⅤ法检测T淋巴细胞凋亡，ELISA法检测T细胞分泌IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-4的水平，流式细胞术检测T细胞中CD4+CD25+细胞的比例。　　结果:PDMSCs对PHA激活的外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用，但对其凋亡无影响。可增加T细胞中G0/G1期细胞数量的比例，下调早期活化标志CD25、CD69的表达，增加T细胞分泌IL-10，IL-4的水平，降低T细胞分泌IFN-γ，IL-2的水平，上调CD4+CD25+T细胞在T淋巴细胞中的比例。　　结论:PDMSCs在体外可抑制PHA刺激的T细胞的增殖，改变T细胞周期，抑制早期活化，改变T细胞亚群及细胞因子的分泌是其可能机制。PDMSCs具有免疫负调节作用，在移植免疫的预防及治疗中可能具有重要意义。　　第三部分人胎盘间充质干细胞与免疫抑制药物在单向淋巴细胞混合反应中的相互作用　　目的:将PDMSCs与免疫抑制药物联合在体外作用于单向淋巴细胞混合反应，来检测它们在异体免疫反应中的相互作用。　　方法:PDMSCs单独或与免疫抑制药物（环孢素A/霉酚酸）同时在体外作用于单向淋巴细胞混合反应，MTT法检测T细胞的增殖情况。　　结果:PDMSCs单独在体外作用于单向淋巴细胞混合实验，可抑制反应中T细胞的增殖，且呈细胞数量依赖性。与环孢素A联合后，T细胞增殖抑制率下降，与MPA联合后，T细胞增殖抑制率上升。　　结论:PDMSCs对单向淋巴细胞混合反应中T细胞的增殖有抑制作用，且呈细胞剂量依赖性。与免疫抑制药物（环孢素A/霉酚酸）联合后，环孢素A可以减弱PDMSCs对T细胞增殖的抑制作用，霉酚酸可以增强PDMSCs对T细胞增殖的抑制作用。如将PDMSCs与免疫抑制药物联合用于预防及治疗免疫排斥，免疫抑制药物的选择一定要慎重。