慢性乙型肝炎和肝癌患者miR-122、miR-375表达分析

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背景和目的:  乙肝病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染是一个引起广泛肝脏疾病的全球性健康问题,包括急性或慢性乙肝病毒感染。急性HBV感染可治愈或进展为慢性。慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)与慢性肝炎、肝硬化和肝癌相关。据估计,全世界超过3.5亿病人有慢性HBV感染,这些患者中的大多数生活在亚太地区。每年超过一百万死亡的发生是由慢性乙型肝炎直接导致。虽然核苷酸类似物药物、抗病毒核苷酸药物以及干扰素(IFN)广泛使用,但仍不能够使大多数患者HBV感染终止。更深入地了解HBV与宿主相互作用是新的抗病毒治疗策略的前提,近来有关决定病毒的持久性和清除乙肝病毒复制过程中的表观遗传机制已进行了许多研究和进展,包括病毒的DNA甲基化、乙酰化组蛋白复合体和microRNA(miRNA)的调控。  MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在18-25个核苷酸左右的内源性非编码单链小分子RNA。miRNA在进化上高度保守,具有转录后基因调控功能,在多种生理和病理过程中发挥作用。人类细胞基因组编码有1000多种miRNA,这些miRNA调节60%编码蛋白基因。有研究报道,在慢性乙型肝炎肝损伤患者和肝癌患者的肝细胞和外周血清中存在多种miRNA的表达改变。为了探讨miRNA成为慢性乙型肝炎潜在的辅助诊断检测标志物及其与肝癌的关系,我们对610例慢性乙肝患者和30例肝癌患者血清和组织中的miR-122和miR-375进行了检测和分析。  材料与方法:  1、标本:按照慢性乙型肝炎诊断标准(2010年版)选取2012年-2013年河南省省直第二医院、郑州大学第二附属医院,经检测诊断为慢性乙肝病人610例;同时选取健康体检者610例作为对照组;选取2012年-2013年河南省肿瘤医院、河南省人民医院、郑州大学第一附属医院原发肝癌手术切除病人30例。  2、血清标本HBVDNA定量检测:提取各组标本血清病毒DNA;采用湖南圣湘生物科技有限公司(PCR-荧光探针法)乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量测定试剂盒进行荧光定量PCR检测。  3、血清标本乙肝五项定量检测:使用郑州安图绿科生物工程有限公司化学发光乙肝五项定量检测试剂盒对各组标本进行检测。  4、血清标本中miR-122和miR-375表达测定:使用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒提取血清标本中miRNA,然后使用上海吉玛制药技术有限公司Hairpin-itTMmiRNA(miR-122和miR-375)定量检测试剂盒检测血清标本中miR-122和miR-375表达水平。  5、肝癌组织标本中miR-122和miR-375表达测定:提取组织标本中miRNA,然后使用上海吉玛制药技术有限公司Hairpin-itTMmiRNA(miR-122和miR-375)定量检测试剂盒检测组织标本中miR-122和miR-375表达水平。  6、统计学分析:使用SPSS17.0软件分析数据,两样本间比较使用t检验,多样本间比较使用单因素方差分析,P<0.05作为显著性水平。  结果:  1、HBVDNA检测结果:610例慢性乙肝患者HBVDNA均为阳性,其HBVDNA均大于4.001gIU/mL;而对应的610例正常体检者HBVDNA均为阴性。30例原发肝癌病人外周血HBVDNA为阳性24例(HBVDNA>3.001gIU/mL),阴性6例。  2、乙肝五项检测结果:健康对照组610例乙肝五项全部阴性;慢性乙肝组610例HBsAg全部阳性,HBeAg阳性104例,所有指标均符合慢性乙肝诊断标准。30例原发肝癌病人乙肝五项检测结果显示:HBsAg阳性病例24例,与血清HBVDNA检测结果一致,其中乙肝大三阳(HBsAg,HBeAg,抗-HBc阳性)病例14例,小三阳(HBsAg,抗-HBe,抗-HBc阳性)病例10例。  3、慢性乙肝组和健康对照组miR-122和miR-375检测结果:慢性乙肝组610例标本血清中miR-122和miR-375相对表达量分别为11.22±2.54和6.62±1.39,均显著高于健康对照组,差异有显著性(p<0.01)。  4、miR-122表达与慢性乙肝指标的关系:在慢性乙肝组的610例病人中,HBeAg阳性病人的miR-122相对表达量最高(13.72±2.41),HBeAg阴性的非活动性携带者miR-122相对表达量最低(8.12±0.76),与其他类型差异均有显著性(p<0.05)。提示在不同慢性乙肝病人中miR-122表达水平升高存在差异,其中HBeAg阳性病人的miR-122表达水平升高最显著,而HBeAg阴性的非活动性携带者的miR-122表达水平升高少。  5、miR-375表达与慢性乙肝指标的关系:在慢性乙肝组的610例病人中,HBeAg阳性病人的miR-375相对表达量最高(8.11±1.34),与非活动性携带者、高复制ALT正常病人比较,差异均有显著性(p<0.05)。说明在不同慢性乙肝病人中miR-375表达水平升高存在差异,其中HBeAg阳性病人的miR-375表达水平升高最显著。  6、肝癌组织miR-122和miR-375检测结果:30例肝癌组织中miR-122和miR-375相对表达水平分别为16.74±4.31和14.22±3.83,均显著高于癌旁正常组织,差异有非常显著性(p<0.01)。  7、miR-122和miR-375与肝癌病理学特征的关系:miR-375相对表达水平与患者年龄、性别、肝癌的大小、肿瘤分化程度和TNM分期均无关(p>0.05);而miR-122相对表达水平与肝癌大小、肿瘤分化程度以及TNM分期显著相关(p<0.05)。  结论:  慢性乙肝患者血清中miR-122和miR-375相对表达量显著升高;不同慢性乙肝病人中miR-122和miR-375表达水平升高存在差异,其中HBeAg阳性病人的升高最显著,而非活动性携带者的升高最少。  肝癌组织中miR-122和miR-375表达升高,并且miR-122相对表达水平与肝癌大小、肿瘤分化程度以及TNM分期显著相关。
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