周围神经组织由于其结构、功能复杂,一旦发生损伤则致残率高、预后差、治疗复杂,成为当前临床的一大重要难题。传统的自体神经与异体神经移植仍然是临床治疗周围神经缺损的常用方案,然而其本身的局限性极大的限制了它们的广泛应用。神经组织工程的兴起为周围神经修复提供了新的方向。当前神经组织工程领域的研究主要集中在支架材料、支架结构、神经细胞、神经因子、电刺激信号等几个方面。本研究从组织工程的支架、细胞和因子三大要素着手,提出制备三种新型神经导管支架。首先,聚吡咯(Ppy)因为具备良好的生物相容性和导电性能,利用其制备聚吡咯涂层神经导管支架,在支架材料上实现创新,同时结合电刺激信号进行体外研究;然后,仿生神经内膜结构,以纳米纤维海绵作为填充物制备纳米纤维海绵填充式神经导管支架,在支架结构上实现创新;最后,因为聚多巴胺纳米球(PDA NPs)具有良好的生物相容性,且具备负载神经生长因子(NGF)的能力,利用其介导NGF制备可缓释NGF的复合水凝胶填充式神经导管支架,同时在神经因子和支架结构上实现创新。具体来看,本文的研究内容与结果可以概括为以下几个部分:(1)以吡咯为单体,利用原位氧化聚合和静电纺丝技术相结合将聚吡咯涂层在聚乳酸己内酯共聚物/丝素蛋白(PLCL/SF,75/25,w/w)纳米纤维表面,制备得到聚吡咯涂层的PLCL/SF纳米纤维膜。使用三种不同浓度的吡咯单体进行原位聚合反应,制备得到三种不同的Ppy涂层PLCL/SF纳米纤维膜(PLCL/SF-Ppy-1,PLCL/SF-Ppy-2和PLCL/SF-Ppy-3)。扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)和傅里叶红外光谱(FTIR)结果证实了Ppy被成功涂覆在PLCL/SF纳米纤维表面。对三种纳米纤维支架的热稳定性能、降解稳定性、导电性能、力学性能、亲水性能进行表征,结果一方面表明了Ppy涂层后的纳米纤维膜具有较好的热稳定性、降解稳定性和导电性能,另一方面也证明Ppy涂层改善了PLCL/SF纳米纤维膜的亲水性,而且这种改善作用随着吡咯含量的增加而增加。结合电刺激,分别用三种纳米纤维膜培养雪旺(SC)细胞和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞,发现导电Ppy涂层可以明显促进SC细胞的增殖和PC12细胞的分化,而且这种促进作用随着导电性提高而更加显著。因此,上述结果表明PLCL/SF-Ppy-3纳米纤维膜具有更好的神经组织工程应用潜力。进一步利用PLCL/SF-Ppy-3神经导管支架进行体内修复大鼠10mm坐骨神经缺损,结合组织学染色、免疫组化、免疫荧光以及透射电子显微镜(TEM)结果表明聚吡咯涂层可以显著促进大鼠神经营养细胞的增殖、神经轴突和髓鞘的再生,术后坐骨神经功能指数(SFI)分析结果表明其具有促进神经功能的恢复,且修复结果与自体移植组类似。因此,聚吡咯涂层神经导管支架具有在神经组织工程应用的潜在价值。(2)首先,利用静电纺丝技术制备PLCL/SF(20/80,w/w)纳米纤维,然后利用高速匀浆技术将纳米纤维在叔丁醇溶液中分散成纳米短纤维,最后利用冷冻干燥制备得到纳米纤维海绵。SEM结果表明该纳米纤维海绵是由纳米纤维组成。孔径与孔隙率分布测试结果显示其孔隙率为88.81±1.13%,孔径分布为0-100μm。循环压缩力学测试结果表明该纳米纤维海绵具有良好的抗压缩弹性。利用该纳米纤维海绵作为填充物填充进入PLCL/SF(75/25,w/w)中空纳米纤维神经导管中得到纳米纤维海绵填充式神经导管支架,体外培养结果显示SC细胞培养7天后在纳米纤维海绵填充式神经导管有1.5-2.0 mm的纵向长入,表明该支架具有大孔隙结构能够促进SC细胞生长和粘附。进一步进行体内的移植实验,SFI值、Masson染色以及肱三头肌湿重比统计结果均显著表明三组神经功能的恢复情况从好到差依次为:自体移植组>纳米纤维海绵填充式神经导管组>中空神经导管组。同样,组织学染色、免疫荧光、免疫组化和TEM结果也得出相同的结果,并发现纳米纤维海绵填充式神经导管可以促进和引导SC细胞迁移增殖,并迅速引导髓鞘的再生和轴突的延伸,进而更好的促进神经组织的修复和再生。因此,该支架能够很好的促进神经再生和神经功能恢复,在神经组织工程中表现出潜在的应用价值。(3)以多巴胺为单体,氧化聚合制备得到聚多巴胺纳米球(PDA NPs)。采用响应面法实验对制备聚多巴胺纳米球的反应条件进行优化,最终得到最佳反应条件为:多巴胺浓度为10 mg/mL,pH值为9,反应时间为9 h。经过SEM和激光粒度仪表征PDA NPs的粒径大小为324.2±13.9 nm,且粒径分布较为均匀(PDI值为0.231)。综合FTIR和拉曼光谱(RS)的结果表明PDA NPs被成功合成。以PDA NPs作为载体,利用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)共价接枝的方法将神经生长因子NGF接枝在PDA NPs表面,得到可以缓释NGF的聚多巴胺纳米球(NGF@PDA NPs)体系。SEM和激光粒度仪检测结果表明NGF的接枝并不会影响到聚多巴胺纳米球的粒径大小与粒径分布。FTIR和RS结果证实了NGF被成功接枝在PDA NPs表面。此外,体外缓释与MTT结果表明NGF@PDA NPs表面的NGF可以缓慢释放出来,并保持其生物活性达到促进SC细胞增殖的目的。结合三维(3D)打印技术,将NGF@PDA NPs与明胶/透明质酸水凝胶混合后3D打印得到复合水凝胶纤维。并进一步将其取向排列填充到PLCL/SF(75:25,w/w)中空神经导管中。体外降解实验表明,可以缓释NGF的复合水凝胶纤维具有良好的生物降解性能。体外MTT实验表明,该复合水凝胶纤维神经导管不仅具有良好的生物相容性,而且随着NGF的缓释表现出促进SC细胞增殖的能力。因此,制备的聚多巴胺纳米球介导的可缓释NGF复合水凝胶填充式神经导管具有很大潜力作为周围神经缺损的修复材料。综上,本论文结合当前的研究热点,提出制备三种新型神经导管支架,并分别在体内、外水平探究这些支架在周围神经缺损中的应用。本文的研究工作为神经组织工程在周围神经缺损上的应用提供了理论研究基础。