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目的： 利用本实验室成功构建的稳定表达可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部-Fc抗体(sTNFRⅡ-gAD-Fc)融合蛋白的重组CHO-S工程细胞株，经过扩种，在7.5 L CelliGen(R)310搅拌式生物反应器中实施片状载体篮式贴壁培养和全悬浮批式及流加培养，同时进行转瓶平行试验，比较不同培养过程的生产效率，建立一套稳定高效的sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的制备工艺，为进一步优化重组CHO-S细胞培养过程和sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白迈向产业化奠定基础。利用转瓶初步探索人前列腺癌PC-3细胞微载体培养技术，为生物反应器微载体培养PC-3细胞以及基于PC-3细胞培养的肿瘤疫苗中试生产提供支持。 方法： 1、筛选细胞悬浮培养无血清培养基:选择本实验室现有的几种无血清培养基包括化学成分限定培养基LK021、化学成分限定培养基CD-CHO、B001，以含8％NBCS的DMEM/F12培养基作为对照培养CHO-S细胞，通过细胞计数及蛋白点杂交检测最终蛋白表达量，选出最适合sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白高效表达制备的无血清培养基。 2、利用B001无血清培养基驯化重组CHO-S工程细胞株，使其适应全悬浮培养;悬浮驯化运用直接适应法，将处在对数生长期的贴壁生长重组CHO-S细胞消化后，直接换成无血清培养基制成单细胞悬液，转至试剂瓶于摇床中悬浮培养。 3、考察重组CHO-S细胞培养中丁酸钠的添加浓度:将重组CHO-S细胞以3×105 cells/mL的密度接种于12孔板中，24h后换成含不同浓度丁酸钠的新鲜培养基，每日细胞计数，点杂交半定量表达水平。 4、7.5 L CelliGen(R)310搅拌式生物反应器中实施片状载体篮式贴壁培养和全悬浮批式及流加培养，同时进行转瓶平行试验。 5、细胞的生长及代谢检测:每24h取样，台盼蓝拒染法计数活细胞，试剂盒监测营养及代谢产物浓度。 6、sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的半定量:使用抗人TNFRⅡ单抗进行蛋白点杂交检测目标蛋白表达水平。 7、收获重组CHO-S细胞培养上清，离心过滤后经Pellicon切向流超滤系统进行初步浓缩。 8、ProteinA亲和层析柱(Bio-Rad)分离sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白。 9、MTT法体外检测sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白对抗TNFα杀伤L929细胞的生物学功能。 10、Cytodex3微载体的预处理:称取适量Cytodex3微载体，经PBS水合、洗涤后，高压灭菌;使用前用培养基润洗一次，再用新鲜培养基平衡过夜。 11、玻璃容器的硅化:利用SigmacoteTM(Sigma ChemicalCo.)硅化液按标准操作步骤进行硅化处理，防止Cytodex3粘附。 12、PC-3细胞微载体培养:取对数生长期的贴壁培养细胞，消化后制成单细胞悬液，以3×105cells/mL终体积的密度、2/3终培养体积接种于转瓶，初期低速旋转后以适当速度连续旋转培养，每24h取样细胞计数及代谢物检测。 13、微载体培养细胞计数:取1mL微载体悬液，800rpm离心3min，弃上清，加入1mL含0.1％(w/v)结晶紫染色液于37℃温育1h，血球计数板计数细胞核。 结果： 1、不同无血清培养基条件下的细胞生长情况有差异，B001培养的细胞其活率基本保持恒定，蛋白表达量最高，在30ug/mL-40ug/mL之间，选定B001作为sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白制备的无血清培养基。 2、通过为期五天的连续培养，发现丁酸钠明显抑制细胞的生长，添加2mM丁酸钠时，最高细胞数较对照组下降了31％;然而蛋白点杂交检测结果显示丁酸钠对重组蛋白的表达具有促进作用，且2mM的丁酸钠处理使CHO-S细胞获得最高表达量;综合考虑，选择在细胞培养液中添加2mM的丁酸钠，以使细胞高效表达。 3、重组CHO-S细胞生物反应器全悬浮培养的最高目标蛋白表达量在40mg/L以上，与片状载体篮式贴壁培养和转瓶悬浮培养相比分别提高了3倍和1倍; 4、Pellicon切向流超滤系统对sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的浓缩效果佳，回收效率达到96.4％。 5、sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白具备拮抗TNFα杀伤L929细胞的生物学活性，且在一定程度上高于hTNFR-Fc 6、PC-3细胞的平板效率平均为29％。 7、初期低速旋转，PC-3细胞能较好的贴附于Cytodex-3微载体表面。 8、微载体的使用浓度需适宜，约3g/L; PC-3细胞的接种密度为3×105cells/mL时微载体的细胞负载率可达100％。 结论： 本实验通过无血清培养基的筛选和优化，成功实现重组CHO-S细胞在搅拌式生物反应器中的高表达，建立了一套稳定高效的sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的制备工艺，所采用方法和控制策略为优化CHO-S细胞培养过程和sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白迈向产业化奠定了基础。在转瓶中，PC-3细胞可在Cytodex-3微载体上较好的粘附生长，但生物反应器微载体培养工艺能需进一步优化。