由大肠杆菌引起的仔猪腹泻仍是一个没有完全解决的问题,给养猪业带来的损失不可低估;新近发现的携带耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的大肠杆菌使得仔猪腹泻的病原更具复杂性。因此深入研究HPI主要结构基因与HPI毒力岛的关系,以减少HPI毒力岛对养猪业的影响。本实验主要针对ybtA、fyuA基因进行研究。在HPI毒力岛中ybtA属AraC转运调节家族。它促进fyuA、irp2和irp6启动子的表达却抑制自身启动子。fyuA与铁的吸收有关,是Ybt、细菌素以及巴氏杆菌素的外膜受体。为了进一步了解HPI毒力岛的生物学特性,该研究根据GenBank发表的大肠杆菌HPI毒力岛(high pathogenicity island,HPI)主要结构基因fyuA、ybtA的基因序列,分别设计一对特异性表达引物,经PCR方法从大肠杆菌HPI毒力岛阳性菌株S711100扩增出fyuA 1960 bp、ybtA 840 bp的基因片段,并定向克隆入载体pUCm-T载体,转化大肠杆菌DH5α;经双酶切获得目的片段后,分别插入到表达载体pGEX-6P-1的GST基因下游,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组表达质粒pGEX-6P-1-fyuA、pGEX-6P-1-ybtA。诱导表达后重组菌裂解物经SDS-PAGE及Western-blot分析证明,获得的重组表达质粒pGEX-fyuA、pGEX-ybtA,分别能够表达分子量为98.37 kDa、60 kDa的蛋白,从而为研制抗GST-FyuA、抗GST-YbtA的多克隆抗体提供了抗原。fyuA、ybtA基因表达的蛋白都以包涵体形式存在,利用切胶回收的方式纯化表达产物GST-FyuA、GST-YbtA作为免疫原,分别免疫2只质量3 kg的雄性新西兰大白兔,进行三次免疫,制备兔抗猪GST-FyuA、GST-YbtA蛋白多克隆抗体,用间接ELISA和Western blot进行检测,证明制备的多克隆抗体具有较高的亲和性;可以与GST-FyuA、GST-YbtA蛋白特异性结合。为下一步检测fyuA、ybtA单基因缺失株提供了多克隆抗体。为了深入研究ybtA、fyuA与HPI毒力岛的关系,本实验选择S711100、S793103两株HPI+大肠杆菌菌株为对象,利用Red同源重组技术分别敲出HPI毒力岛的关键基因fyuA 50 bp-1972 bp序列和ybtA 50 bp-910 bp序列,构建fyuA和ybtA单基因缺失株。通过Western blot方法,用实验中制备的抗GST-YbtA和抗GST-FyuA抗体检测ybtA、fyuA单基因缺失株及原始菌株S793103菌株蛋白表达情况。以确定fyuA和ybtA的缺失对HPI毒力岛相关蛋白表达的影响,结果表明ybtA、fyuA在原菌株S793103中表达,但在单基因缺失株中未表达。为进一步研究大肠杆菌高致病性毒力岛(HPI)的致病机理及免疫机理打下了重要基础。