论文部分内容阅读
目的:课题组前期运用蛋白质组学方法筛选鉴定丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A3(SERPINA3)在胃粘膜癌变过程中表达下调,了解其在胃粘膜癌变过程中的功能,将为阐明胃粘膜癌变的分子机制提供理论依据。方法:1、构建SERPINA3干扰载体,转染GES1细胞,筛选后建立SERPINA3低表达GES1细胞系(GES1-miR-SERPINA3);2、采用免疫荧光和Western-blot方法检测GES1-miR-SERPINA3细胞中SERPINA3蛋白的表达情况;3、通过绘制细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验、平皿克隆形成实验和流式细胞仪等方法,观察SERPINA3低表达对GES1细胞生长增殖的影响。4、Western-blot检测GES1-miR-SERPINA3细胞中Wnt1与β-catenin的表达。结果:1、GES1-miR-SERPINA3细胞的生长速度较对照组细胞(GES1与GES1-pcDNA6.2)明显加快(P<0.01),细胞生长曲线结果说明,SERPINA3低表达后GES1细胞生长能力增强;2、GES1、GES1-pcDNA6.2与GES1-miR-SERPINA3细胞克隆数分别为48.24±8.12、52.14±10.14和92.32±15.41(个),GES1-miR-SERPINA3细胞的克隆较对照组细胞(GES1与GES1-pcDNA6.2细胞)体积明显增大、数目增加(P<0.01),平皿克隆形成实验结果说明,SERPINA3低表达后GES1细胞的增殖能力增强;3、GES1、GES1-pcDNA6.2与GES1-miR-SERPINA3细胞集落数分别为144.26±12.31、153.42±16.13和258.28±32.36(个),GES1-miR-SERPINA3细胞的集落较对照组细胞(GES1与GES1-pcDNA6.2)体积明显增大、数目增加(P<0.01),软琼脂集落形成实验结果同样说明,SERPINA3低表达后GES1细胞的增殖能力增强;4、GES1、GES1-pcDNA6.2与GES1-miR-SERPINA3细胞S期(%)细胞比分别为30.54±2.54、30.02±2.45和51.17±3.92,G1期(%)细胞比分别为50.78±2.16、51.67±2.58和23.65±1.25,细胞增殖指数分别为49.22、48.33和76.35,流式细胞检测结果说明,SERPINA3低表达后GES1细胞中S期比显著增加,G1细胞比显著降低,细胞增殖指数增加(P<0.01);另外,GES1、GES1-pcDNA6.2与GES1-miR-SERPINA3细胞凋亡率分别为17.81±2.28、18.33±2.34和8.46±1.08,流式细胞检测结果说明,SERPINA3低表达后GES1细胞中细胞凋亡率降低(P<0.01)。5、GES1-miR-SERPINA3细胞中Wnt1蛋白的表达较GES1与GES1-pcDNA6.2细胞增加,同时β-catenin蛋白表达也增加,其磷酸化水平降低(P<0.01)。结论:SERPINA3低表达后,GES1细胞生长增殖速度加快,细胞凋亡减少,可能与活化Wnt1/β-catenin通路有关。