一、研究背景与目的脊髓损伤常导致脊髓损伤节段以下的运动感觉功能的丧失,对患者进行康复治疗,给社会和患者的家庭带来巨大的负担.。鉴于此,大量的学者采用基于干细胞移植治疗脊髓损伤进行了尝试,部分研究取得了不错的实验效果,对损伤脊髓的康复发挥明显的促进作用。多种人工合成材料、天然材料被用于合成修复脊髓损伤的支架,并复合各种干细胞修复脊髓损伤。基于人工合成材料合成的支架具有可降解性,极好的机械强度,能作为脊髓损伤局部的运输工具等优点；但这些支架也有不可忽视的缺点：如支架降解可使移植支架的局部环境有害降解产物聚集,改变损伤局部微环境,导致组织细胞的死亡(包括移植入体内的干细胞)。那么天然材料合成的支架是否没有这些缺点呢?已有的研究结果显示,基于天然材料合成的用于治疗脊髓损伤的支架有很好的吸附粘连性,降解产物不会改变损伤部位的微环境；然而这些天然材料合成的支架也具有如下问题：①物理支撑强度不高,②与损伤脊髓修复速度不匹配的降解率。因此,基于人工材料及天然材料合成支架都必须改进方能用于脊髓损伤的修复。目前有许多报道将去细胞组织支架用于脊髓损伤修复,去细胞组织支架拥有很多优良的天然属性：①三维立体空隙结构,②降解产物无毒性,③柔软的质地,④与损伤脊髓修复同步的降解率等优点,完全弥补了合成材料的不足；去细胞组织支架能很好的模拟细胞外基质,有很好的潜能促进神经的再生及促进功能的恢复。由于相当容易获取以及较低的免疫抗原性,BMSCs是最好的治疗脊髓损伤的干细胞之一。使用骨髓基质干细胞修复脊髓损伤是因为这些细胞有潜能分化为神经组织来替损伤部位凋亡的脊髓组织。并且这些细胞移植入体内后还可以在损伤部位释放出大量的神经生长相关的因子,这些因子是神经组织的保护剂,同时还能促进神经轴突的发芽再生。这种基于干细胞移植的治疗策略需要移植入损伤部位大量的干细胞,并提高干细胞在体内的存活率,才能有效治疗脊髓损伤。本实验中,我们采用去细胞脊髓支架复合骨髓基质干细胞治疗脊髓损伤,我们通过对大鼠半切损伤模型移植去细胞脊髓支架及BMSCs复合体,观察其是否能够保护大鼠损伤的神经组织及轴突,并促进脊髓损伤大鼠运动功能康复的作用。二、研究方法1、骨髓基质干细胞的增值与鉴定。2、去细胞脊髓支架的制作。大鼠,麻醉后(10%水合氯醛；60 mL/kg)取新鲜胸段脊髓置于4。C PBS溶液中。对脊髓的萃取参考已有文献：脊髓通过Triton X-100(Amresco)和sodium deoxycholate(Amresco)萃取两次,0.01%PBS溶液清洗三遍,每次1小时。冻干,辐照灭菌备用。3、骨髓基质干细胞标记BrDU合并去细胞支架共培养。4、模型的制备与行为移植术后的行为运动功能评分。大鼠后肢的运动功能通过在开阔地方的BBB评分系统评估,大鼠在开阔平坦的地方通过两人独立评分,从术后到第8周,评估结果记为0-21不等的数值结果。5、RT-PCR:通过反转录酶-聚合酶链锁技术检测既定基因NESTIN, GFAP, GALC和TUBB3等基因在移植术后的移植部位第二周及第八周的相对表达量(n=3)。6、免疫荧光及定量分析脊髓损伤组织染色切片。7、脊髓组织标本Caspase-3的活性分析8、新鲜脊髓在麻醉下取包括移植部位的脊髓2CM长,4%多聚甲醛及戊二醛固定,并按已有文献(Dasari et al.,2007)完成电镜切片,准备透视电镜(TEM)。9、使用statistical analysis software SPSS 13.0软件对实验中的多组均数采用one-way ANOVA分析,多重数据采用LSD方法进行数据统计分析。三、研究结果1、BMSCs的鉴定我们成功的冲胫骨及股骨的骨髓腔分离并扩增了BMSCs,并在细胞孵箱中培养至细胞的三代。将记过处理的第三代细胞BMSCs,放入流式细胞仪内,检测分析后得出如下结果：BMSCs表达造血细胞表面相关的表型CD34(2.320%)。强表达CD90 (99.99%), CD29 (94.00%), CD105 (99.71%)及CD73 (99.60%) (Fig.1),本实验结果和已有相关文献报道的结果相符,证明本次实验所用细胞是骨髓基质干细胞。2、去细胞脊髓支架复合骨髓基质干细胞移植入半切脊髓损伤新鲜脊髓经过化学萃取后,留下了去细胞支架,去细胞脊髓支架显现出半透明,柔软的状态(Fig.-2 A),通过扫描电镜拍照,图片显示处理后的支架体现出较高的孔隙率；呈三维立体的多孔蜂窝状结构(Fig.2 B)。经过马松三色染色法染色显示去细胞脊髓支架呈蓝色,由胶原纤维组成(Fig.2 C)。总数为5×105的BMSCs种植到去细胞脊髓支架上,加入20%胎牛血清的DMEM 培养基在38℃培养2天,复合上细胞的支架相比未复合细胞的支架,由半透明变为乳白色,也具有更高的机械支撑强度。放到扫描电镜下,可见细胞很好的粘附到了支架的空隙里(Fig.2 D,E), HE染色可以看到细胞均匀分布在支架上(Fig.2,F)。支架细胞复合体在术后立即植入大鼠损伤部位。3、运动行为评估所有实验组的大鼠在术后立即评分,在术后右后肢的评分结果为0,处于瘫痪状态,结果示造模成功(Fig-3)。BBB评分在损伤后的八周逐步提高。在对大鼠实施支架治疗组(包括支架组、支架复合细胞组)的BBB评分在8周时明显比对照组高。各组的BBB评分为：细胞复合支架组(17.88±0.39),单独支架组(13.77±0.79),对照组(8.22±0.49)。虽然在术后两周内,所以组的大鼠的BBB评分都明显升高,但细胞复合支架组的BBB评分上升是更明显的,细胞支架组两周时(12.92±0.66),单独支架组(9.23±0.80)。这些2周及8周的BBB评分经统计学分析具有统计学意义(P<0.05)(Fig.3)。以上结果充分支持骨髓基质干细胞联合去细胞支架治疗大鼠脊髓损伤,能很好的促进瘫痪的后肢功能的恢复。4、骨髓基质干细胞分化为神经细胞的组织学评估及免疫荧光分析我们通过免疫荧光染色来评估去细胞脊髓支架在神经保护方面的作用。BMSCs复合到去细胞脊髓支架上并移植到脊髓损伤部位,我们通过染色发现支架复合物和大鼠自身组织无缝完整的结合,在移植物与自身组织间无空隙留下,能对损伤的头尾部因损伤形成的缺损进行有效的连接(Fig.4A, B, C)。 BMSCs在移植入体内2周、8周时免疫荧光染色,结果显示都表达了神经前提细胞特有的标记物NESTIN,2周时NESTIN的单位面积内的阳性表达(9.15±0.76)比8周时(3.35±0.37)的阳性表达明显,经统计具有统计学意义(P<0.05)(Fig.4D)。本结果说明BMSCs移植入体内后,随着时间的延长,逐渐分化为神经细胞,代替损伤死亡的神经细胞组织。标记有BrdU的BMSCs移植入体内后,在术后2周及8周时都可以在支架及自身的神经组织内观察到BrdU阳性的细胞分布(Fig.5E,F,Fig.6E,F)。我们通过IPP (Image-Pro-plus software)软件分析可以看到细胞复合支架治疗组术后8周时BrDU阳性的数量(0.03±0.004)较2周时(0.09±±0.007)明显减少(Fig.5 G),经统计学分析具有统计学意义。在单独支架组及对照组未发现BrDU阳性染色。被结果反映了ASC支架能够延长干细胞在体内的存活时间。GFAP和GALC是两个用来评估干细胞在体内分化为胶质细胞的标记物。GALC反应的是向少突胶质细胞分化,GFAP是反映干细胞向星形胶质细胞分化。少突胶质细胞和星形胶质细胞是在术后2周及8周免疫荧光染色呈现的分布在治疗组支架上的两种主要的细胞。结果经过IPP分析显示在细胞复合支架组术后8周时GALC和GFAP的阳性率(GALC 0.13±0.01, GFAP0.32±0.04)比2周时阳性率高(GALC 0.10±0.007, GFAP 0.18±0.04) (Fig.5 H)以及(Fig.6 G),统计学意义显著(P<0.05)。并且细胞复合支架组在2周、8周时3ALC与GFAP的阳性率比单独支架治疗组和对照组高。该实验结果提示去细胞脊髓支架移植进入损伤部位,可以为干细胞进入体内存活并分化提供有效载体,使干细胞向能够很好的向星形胶质细胞,少突胶质细胞等神经细胞分化,并作为桥梁使干细胞能向大鼠神经组织迁移。5、移植治疗后的mRNA表达的改变在移植手术后的2周及8周处死大鼠收集脊髓标本,通过Q-PCR技术检测GFAP, GALC, TUBB3和NESTIN基因的表达变化。在细胞复合支架组术后8周时GFAP, GALC和TUBB3的表达量比同组2周时,及单独移植支架的8周及2周都明显的表达(P<0.05)(Fig.7A,B,C);而NESTIN在术后2周的表达量比8时的表达量高(P<0.05)(Fig.7D),支架组及对照组无明显改变。结果反应了术后BMSCs复合支架移植加强了GFAP, GALC, NESTIN和TUBB3基因的表达,从基因层面反应了部分移植入体内的干细胞分化为胶质细胞(Fig.7)。6、细胞复合支架移植改变caspase-3的活性我们通过酶标仪检测caspase-3的活性来检测术后8周损伤部位的细胞凋亡。实验结果显示,细胞复合支架移植治疗组(0.21±0.001)在术后8周,caspase-3蛋白活性和单独支架组(0.37±0.022),对照组(P<0.05)(Fig-8)相比,明显降低。结果反应了细胞复合支架治疗大鼠脊髓损伤能明显降低损伤部位的细胞凋亡,从而起到保护脊髓损伤后损伤部位组织的作用。7、透射电镜观察脊髓损伤后,在己损伤的局部移植入细胞支架复合体后的超微结构的变化通过透射电镜观察评估完成。虚线吧移植物和自身组织区分开(Fig.9 A)。在术后8周时我们可以观察到单独移植支架组的损伤区的神经脱髓鞘(Fig.9 a)发生明显严重于细胞复合支架治疗组(Fig.9 c),我们通过致密髓鞘上形成的空泡的多少来得出此结论。此外我们还可以观察到细胞复合支架组在损伤部位有明显的新生髓鞘形成(Fig.9d),而单独支架组则无明显形成(Fig.9 b)。本结果直观的显示了细胞复合支架能促进新生髓鞘的形成,能有效抑制自身轴突的脱髓鞘及髓鞘的退变坏死。四、结论本实验研究结果反映了去细胞脊髓支架联合BMSCs能够的明显促进脊髓损伤大鼠的运动功能的康复。去细胞支架复合物不但能促进损伤部位的神经的髓鞘再生,还能保护损伤部位受损伤的神经组织细胞免受二次损伤,因此细胞支架复合物在促进脊髓损伤大鼠的运动康复中起着重要作用一、研究背景与目的脊髓损伤后功能的恢复常取决于两种神经轴突的再生,一种脊髓损伤后残留的神经轴突的出芽再生,在损伤局部形成新的神经信号通路来替代受损伤的神经组织,使运动感觉功能得以部分恢复(1-2)；另一种再生是损伤部位头侧的轴突向尾侧的长距离的桥接式再生,这些再生的神经束对运动感觉的恢复显得尤其重要(3-4)。尽管学者在实验模型上刺激损伤部位轴突再生做了大量的研究(1-4),部分实验去除局部微环境中对轴突再生有抑制的基因(8-10),部分实验为损伤局部输送各种神经生长因子(11),但这些研究在促进轴突大量再生方面的作用十分却有限(5-16)。定义哺乳动物雷帕霉素靶蛋白受体(mTOR)为一种相当保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,它能够整合了机体的营养、细胞间的生长因子及机体能量代谢和应激反应等多条信号通路的功能,从在机体内能有效控制细胞生长、增殖、存活与代谢。有些学者曾通过转基因老鼠敲除pTEN基因,使磷酸化AKT的活性使上升,从而抑制磷酸化TSC-1的活性,使mTOR活性上升,使损伤部位的轴突大量再生；该实验小鼠敲除PTEN基因,使P-akt活性大幅升高,然而P-akt活性升高可以通过MTOR信号通路以外的其余途径来促进脊髓损伤的修复；局部敲除PTEN基因的小鼠,P-Akt及mTOR的活性均升高,所以很难确认谁对促进损伤部位轴突的再生及功能康复的作用大一些。mTOR活性在体内由功能截然不同的两个复合物调控而发挥不同的功能,分别是mTORC1和mTORC2,这两种在mTOR组成中占很大分量的复合物通常接受到一种名为结节性硬化复合物(tuberous sclerosis complex 1/2, TSC1/2)所抑制。mTORC1在体内主要调节细胞生长及机体的新陈代谢,相对mTORC1而言,我们对mTORC2的功能了解较少。在多种创伤性疾病中,包括脊髓损伤,都发现了mTOR信号通路在损伤后过度激活。已有研究显示在局部敲除TSC-1基因,能上调mTORC1的活性,但在脊髓损伤中,敲除TSC-1基因促使脊髓损伤修复的作用机制仍不清楚。目前有多种病毒被作为基因载体用于科学研究,常见的有慢病毒,腺病毒,及腺相关病毒等。慢病毒虽然感染效率较高,但是慢病毒体积大,滴度比较低等特点限制了他在神经研究方面的运用；腺病毒作为载体时基因表达时间较短,滴度高等优点,但是腺病毒的缺点同样明显,腺病毒本身能模拟生长因子,激活mTOR活性。作为一种基因载体,AAV病毒具有安全性好,免疫原性低,能感染分裂细胞和非分裂细胞,能介导基因的长期稳定表达等优点,因此在神经系统的体内和体外研究中,受到越来越多的关注和重视()。有鉴于此,本实验旨在探讨通过腺相关病毒局部敲除中枢神经系统的TSC-1基因,从而使脊髓损伤局部mTOR活性上升,促进脊髓损伤修复的作用机制。二、研究方法1、通过cre-loxp系统原理,本课题组成功构建了中枢神经系统局部特异性Tsc1敲除的小鼠模型。本实验通过使用western blot(蛋白免疫印记实验)实验及切片免疫荧光实验来确认了TSC-1基因的敲除效果。2、通过对中枢神经系统局部敲除TSC-1基因的小鼠制作全横断脊髓损伤模型,并对小鼠密切护理和观察,对造模小鼠进行行为学评估及电生理检测。3、通过组织免疫化学染色、免疫荧光,及Q-PCR检测技术评估局部敲除TSC-1基因,使mTORC1激活对造模小鼠的脊髓组织形态和结构的影响。4、通过western blot检测局部敲除TSC-1基因后损伤局部的mTOR相关的蛋白及脊髓损伤修复的蛋白水平。5、通过Q-PCR技术检测损伤局部新陈代谢加快的技术指标。6、通过BDA逆行示踪技术评估局部敲除TSC-1基因,mTORC-1活化对轴突再生的影响。7、通过对局部敲除基因的小鼠予雷帕霉素灌胃处理,探讨mTORC1活性进行抑制后,敲除小鼠的脊髓生理和形态学变化能否被逆转。8、使用statistical analysis software SPSS 13.0软件对实验中的两组均数采用T检验,多组均数采用one-way ANOVA分析,多重数据采用LSD方法进行数据统计分析。三、研究结果1、腺相关病毒有效感染细胞及宿主,并能有效敲除病毒注射处的TSC-1基因,使mTOR活性明显升高。在本研究中,我们取C57、TSC-1loxp/loxp两种小鼠的骨髓基质干细胞,并分别对两种细胞滴入AAV-GFP, AAV-Cre病毒,发现AAV-Cre病毒能使TSC-1lox/loxp小鼠干细胞的p-S6活性上升,其余组未见明显变化。本结果说明AAV病毒能有效感染细胞,AAV-Cre病毒能敲除细胞的TSC-1基因。接着我们对C57、TSC-1loxp/loxp两组小鼠股四头肌局部注射AAV-GFP, AAV-Cre病毒,在注射AAV-GFP病毒的局部肌肉中,可以观察到GFP绿色荧光蛋白的表达；通过western blot检测及免疫荧光染色检测,我们可以观察到注射AAV-Cre病毒的TSC-1loxp/loxp小鼠的局部肌肉的p-S6活性明显改变,而C57小鼠组的没有明显的变化,这说明AAV-Cre病毒能在体内敲除TSC-1基因,使mTOR活性升高。2、腺相关病毒有效敲除脊髓组织中的TSC-1基因,mTOR活性升高我们进一步将两种AAV病毒注射到小鼠大脑的的运动皮质区域,两周后观察取胸8节段偏尾侧的脊髓组织做免疫荧光检查,结果显示AAV-Cre病毒注射组脊髓的p-S6活性明显比注射AAV-GFP组高；通过IPP软件对p-S6阳性染色组织进行统计,显示AAV-Cre组p-S6阳性染色组织是AAV-GFP组的2.75倍。3、腺相关病毒在脊髓敲除TSC-1基因,未引起其余mTOR信号通路的基因改变。取大脑皮质注射过AAV的脊髓目的组织,制备蛋白样品,并通过实验western blot实验检测,结果显示TSC-1loxp/loxp注射AAV-Cre病毒的小鼠大脑和脊髓组织的TSC-1蛋白表达量较注射AAV-GFP病毒组低,使p-S6蛋白表达正好相反,注射AAV-Cre病毒组的p-S6蛋白表达相对较高；而其余的mTOR信号通路相关的蛋白如：PI3K, p-AKT等蛋白表达量没有明显的变化。免疫荧光染色P-AKT无明显变化,IPP统计显示无统计学差异。这些结果说明,AAV在体内不能引起P13K及p-AKT的改变,而是通过AAV-Cre病毒敲除TSC-1基因使mTOR活性上升。4、腺相关病毒敲除基因组的术后运动功能大幅度提升,以及电生理改善明显。所有实验组的小鼠双后肢在术后立即瘫痪,BBB评分为0,表明造模成功。BBB评分在损伤后的八周逐步提高。在对小鼠实施AAV-Cre病毒注射组的BBB评分(12.18±0.39)在8周时明显比AAV-GFP病毒注射组(6.57±0.79)高。其余从术后1周到8周的BBB评分经统计学分析具有统计学意义(P<0.05)。以上结果显示AAV-Cre病毒注射治疗脊髓损伤的小鼠,更能促进功能的恢复。同时我们在8周时对两组脊髓损伤的小鼠进行了大脑运动皮质诱发电位测试。结果显示AAV-Cre病毒注射组的诱发电位的潜伏期(4.3±0.21)明显短于AAV-GFP病毒注射组(8.62±0.31)；AAV-Cre病毒注射组的诱发电位的振幅(44.35±2.55)明显大于AAV-GFP病毒注射组(28.46±2.12)。这些结果显示AAV-Cre病毒注射治疗小鼠脊髓损伤更能促进小鼠运动功能的康复。5、腺相关病毒敲除基因组脊髓损伤部位微血管再生明显。取大脑皮质注射过AAV的脊髓损伤局部的目的组织,切为冰冻切片,并做血管内皮因子(VEGF)的免疫荧光染色,结果显示AAV-Cre病毒注射组脊髓损伤局部的血管内皮因子染色的阳性表达(0.43±0.05)明显强于AAV-GFP病毒注射组(0.21±0.04)。组织蛋白的western blot实验及Q-PCR分别从蛋白及基因角度支持该现象。6、BDA逆行示踪显示腺相关病毒敲除基因组术后大量轴突再生。在术后6周分别在两组小鼠的大脑运动皮质注入BDA逆行示踪剂,2周后采集脊髓损伤部位的脊髓做免疫组织化学染色,结果显示在两组小鼠的大脑皮质,BDA阳性染色无明显差异,在脊髓损伤部位的尾侧端,AAV-Cre病毒注射组可以看到大量的BDA阳性染色的轴突穿过脊髓损伤区域,而AAV-GFP病毒注射组阳性染色的轴突很少见,由此可见,AAV-Cre病毒在中枢神经系统特异敲除TSC-1基因可大量的促进脊髓损伤部位的轴突再生。四、结论1、腺相关病毒有效感染宿主,并能有效的局部敲除中枢神经的TSC-1基因,使mTOR活性明显升高。2、腺相关病毒在脊髓敲除TSC-1基因,未引起其余mTOR信号通路的基因改变。3、腺相关病毒敲除基因组的术后运动功能大幅度提升,以及电生理改变明显。4、腺相关病毒敲除基因组脊髓损伤部位微血管再生明显。5、BDA逆行示踪显示腺相关病毒敲除基因组术后大量轴突再生。