干扰素是机体细胞随病毒感染或其他生物因素诱生作用反应产生并分泌的一类具有多种生物活性的糖蛋白,能激活别的基因亚群进行转录,从而具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。干扰素-α(interferon-α)和干扰素-β(interferon-β)属Ⅰ型干扰素,分别由白细胞和纤维母细胞产生,具有广谱抗病毒活性和较强的免疫调节活性,对DNA病毒和RNA病毒均具有抑制作用。自1986年基因工程IFN-α2a和IFN-α2b、1990年基因工程IFN-β和1993年IFN-γ相继获准投放市场,基因工程干扰素受到越来越广泛的应用。为了研究和开发牦牛干扰素并用于相关疾病的预防和治疗,本研究克隆了牦牛干扰素-α-A、-α-Ⅱ及干扰素-β基因,并对其进行了原核表达。 采集牦牛外周血分离淋巴细胞,用植物血凝素(PHA)刺激外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用反转录PCR(RT-PCR)技术首先扩增出牦牛干扰素-α-A、α-Ⅱ及干扰素-β基因,将扩增到的基因与pGEM-T-easy载体连接、转化后,进行酶切、PCR以及测序鉴定。结果表明:牦牛IFN-α-A基因ORF为570bp,与乳牛IFN-α-A参考序列同源性为94.4%,与耕牛IFN-α-B同源性为96.8%,与水牛IFN-α-A同源性为62.6%,与猪、马、人IFN-α-A次之,分别为78.1%、77.1%、71.4%,与狗、试验小鼠、家鼠、鸡、家鹅IFN-α-A同源性在65.4%-30.0%之间;牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为588bp,与乳牛IFN-α-Ⅱ参考序列同源性为94.2%,与耕牛IFN-σ-1同源性为95.3%,与水牛IFN-α-Ⅱ为92.8%,与马、猪、人IFN-α-Ⅱ分别为66.7%、63.2%和64.4%,与狗、实验鼠、家鼠、鸡和家鹅IFN-α-Ⅱ同源性59.2%-30.7%之间;牦牛IFN-β基因ORF为498bp,与乳牛IFN-β参考序列同源性最高,为98.6%,其次为猪、马、猫、人,分别为72.5%、68.9%、66.1%和63.5%,与狗、鼠、鸡等同源性都很低,不超过25%。分子遗传进化树分析表明:牦牛IFN-α-A与乳牛和耕牛亲缘关系都近,与水牛较远;牦牛IFN-α-Ⅱ与耕牛、乳牛和水牛亲缘关系近;与其它不同类动物相比较,二者均与猪、马、人、狗和鼠亲缘关系较近,而与鸡和鹅较远;牦牛与乳牛IFN-β亲缘关系最近,与猪、马的次之,而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远。结果说明该三种基因均有种属差异性。 依照各基因开放阅读框(ORF)两侧序列重新设计并合成表达引物,以重组质粒pGEM-T-easy/IFN-α-A、pGEM-T-easy/IFN-α-Ⅱ、pGEM-T-easy/IFN-β为模板进行扩增,扩增产物和pGEX-4T-1质粒分别用BamH Ⅰ和Xhol Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌。经酶切、PCR以及测序鉴定证明,牦牛各基因正确插入到pGEX-4T-1载体。用ITPG诱导重组基因进行表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western-blotting分析,证实牦牛IFN-α-A、IFN-α-Ⅱ和IFN-β基因均在大肠杆菌中均得到了成功表达,目的蛋白与GST形成融合形式,IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ分子量大小约为19ku左右,IFN-β分子量大小约为15ku左右,与预期的大小相吻合,而且可被鼠抗GST血清所