为了建立一种有效的牛结核病间接ELISA方法,本研究设计了3对引物,从牛分枝杆菌ValleeⅢ菌株的基因组中PCR扩增出三个目的基因mpb70、mpb83和esat-6,采用重叠延伸剪接技术（splice by overlapping extension,SOE）获得融合基因mpb70-mpb83。经过多次亚克隆步骤后,将DNA片段mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a（+）中,获得了重组质粒pET70-83-E6。将该重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌感受态后,经IPTG诱导表达带有两个六组氨酸标签的融合蛋白rM70-83-E6。以Ni²⁺鳌合层析的方法纯化该融合蛋白。Western blot分析表明该蛋白具有良好的免疫反应活性。 以融合蛋白rM70-83-E6作为包被抗原,在确定了最佳封闭液和最佳包被条件后,采用正交试验设计的方法摸索了最佳抗原、一抗和二抗稀释度,以及最佳一抗、二抗作用时间和显色时间,建立了检测牛结核病抗体的间接ELISA方法。用150份健康牛血清的检测结果统计分析后确定诊断方法的判定标准,即样本S/P大于0.5为阳性,小于0.4为阴性,两者之间为可疑。 通过对85份牛结核病血清和100份无结核病牛血清的检测结果表明,ELISA方法的敏感性为69.41%（59/85）,特异性为96%（96/100）。对50份PPD阴性血清和67份PPD阳性血清（117份）进行检测,并与PPD皮试进行比较,本方法与PPD皮试诊断的符合率为82.05%。 本研究还进行了试剂盒的初步组装,并将该试剂盒应用于现地血清样品的检测,为产业化开发奠定了基础。研究表明本试剂盒具有较好的应用价值和产业化开发前景。