论文部分内容阅读
蚊媒病是全世界重要的传染病之一，包括疟疾，西尼罗河热等严重危害人类健康的疾病。蚊媒病控制的主要措施是治理蚊媒。化学防治因其速杀、长效、方便等特点，一直是蚊媒综合治理策略中的主要方法。然而随着杀虫剂连续、大量的使用，蚊媒抗药性开始产生和发展。蚊媒抗药性产生和发展加剧了蚊媒病传播的恶化趋势。化学防治因其能够快速，有效控制蚊媒种群，在以后很长的时间内仍是蚊媒治理的主要方法。因此蚊媒抗药性研究仍是控制蚊媒病传播的重点。蚊媒抗药性机制包括3个主要方面。一方面是靶标抗性，即蚊媒杀虫剂靶位点的改变；另一方面代谢抗性，其涉及代谢相关酶类转录水平的变化；此外为生理抗性，如表皮改变影响杀虫剂的穿透性。其中，以代谢抗性研究最多。前期代谢抗性研究关注杀虫剂代谢相关酶活性的改变，未见抗性相关基因转录后调控的研究。本实验初步探索了抗药性基因转录调控机制。miRNA是一类转录后调控的重要因子，广泛存在于动物和植物中。其通过降低mRNA表达或者抑制蛋白质合成参与调控体内近30%的基因。miRNA功能包括调节生物体的生长、发育、凋亡等。目前在蚊中已经开始研究miRNA与抗感染方面的研究，至今未见miRNA和杀虫剂关系的报道。本研究选取在我国分布广泛的重要家栖性病媒蚊种淡色库蚊为研究对象，以近年我国使用最多的卫生杀虫剂溴氰菊酯为材料，采用solexa测序法，比较了溴氰菊酯敏感和抗性淡色库蚊miRNA表达谱；通过PCR、T-A克隆及测序验证了pre-miRNA；采用定量PCR进一步验证了敏感和抗性品系中miRNA表达差异；采用双荧光报告验证了miR-71可以调控杀虫剂代谢酶类CYP325BG3表达。本研究主要结果如下：1通过WHO幼虫浸渍法建立了淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系，其LC50为0.85mg/L，敏感品系LC50为0.03mg/L，抗性系数为28.3。2使用solexa法对淡色库蚊溴氰菊酯敏感和抗性品系进行了成功的测序。送测序mRNA，敏感蚊混合样本浓度为670ug/ml, OD260/0D280为1.80；抗性蚊混合样本浓度为600ug/ml，OD260/0D280为1.83。经过琼脂糖凝胶电泳和安捷伦Bianalyzer检测，RNA完整性良好，测序结果中rRNA的比例小于40%。表明solexa测序结果良好，可以用于继续分析。3对测序得到的原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理，并统计sRNA序列长度分布，可以观测到20-23nt长度的序列所占比例高。将测序结果与最近缘致倦库蚊的基因组进行比对。将上述测序得到的序列（clean序列）按照rRNAetc> known miRNA> repeat> exon> intron的优先级顺序注释。在鉴定淡色库蚊miRNA的时候，根据致倦库蚊基因组序列，提取miRNA前体序列，进行二级结构分析。进一步用miRAlign软件将上述序列与miRBase比对，筛选出淡色库蚊成熟miRNA和预测新的miRNA。在淡色库蚊中共鉴定保守miRNA85个，前体结构91个；新miRNA143个，前体结构209个。同时比较了淡色库蚊敏感和抗性品系中miRNA表达量的差异。4在淡色库蚊miRNA检测中，检测到miR-932、miR-980、miR-998、miR-999等昆虫特有miRNA；miR-1891、miR-1889和miR-2941等蚊特有miRNA。根据miRNA基因簇分析方法，设10K bp为miRNA基因之间排列的最大距离，共发现7个淡色库蚊miRNA簇，其中包括在昆虫中最常见的let-7、miR-125构成的miRNA簇。PCR鉴定了淡色库蚊pre-miRNA，T-A克隆测序了部分淡色库蚊pre-miRNA序列。测序结果显示，与致倦库蚊miRNA前体结构相比，淡色库蚊miRNA的茎部结构保守，而环部碱基突变比较常见。其为淡色库蚊和致倦库蚊的系统分类提供了一种新的可行性。5选取solexa测序后比较有统计学差异的miRNA和昆虫学研究中已有功能报道miRNA进行定量验证。在敏感品系大部分发育阶段，miR-279-3p、miR-13、miR-989、miR-4448和miR-285的表达水平比抗性品系高；miR-317、miR-2b、miR-92a在抗性品系各发育阶段表达水平比敏感品系高。6靶标预测提示，CYP325BG3的3’UTR序列和miR-71可能存在相互作用。采用双荧光报告实验证实，miR-71和CYP325BG3之间确实存在相互作用。结果表明，miR-71可能通过调节CYP325BG3的表达水平参与淡色库蚊溴氰菊酯抗性。本研究首次报告了淡色库蚊抗药性miRNA表达谱，PCR和T-A克隆测序验证了miRNA前体结构，定量PCR鉴定了抗药性相关miRNA。双荧光报告方法验证miR-71可以调控代谢酶类CYP325BG3的表达，进而参与杀虫剂抗性。研究结果丰富了昆虫miRNA数据库，初步探索了miRNA在蚊抗药性中的作用，具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。