【摘 要】
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Hepcidin是一类重要抗菌肽,具有抗菌谱广和作用机制独特等特点。罗非鱼是我国重要的出口品种,但近年深受细菌性疾病困扰。在水生病原菌的耐药性日渐严重的背景下,研究罗非鱼h
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Hepcidin是一类重要抗菌肽,具有抗菌谱广和作用机制独特等特点。罗非鱼是我国重要的出口品种,但近年深受细菌性疾病困扰。在水生病原菌的耐药性日渐严重的背景下,研究罗非鱼hepcidin的重组表达可为新型抗菌药物的开发提供借鉴。本研究拟通过毕赤酵母GS115 (Pichia pastoris GS115)分泌表达TH1-5,并对表达产物的抗菌活性和免疫调节功能进行了初步研究。具体内容和结果如下：(1)TH1-5成熟肽在毕赤酵母中的表达人工合成经毕赤酵母GS115密码子偏好性优化(两端添加EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点)的TH1-5 cDNA,克隆到PUC57-simple载体上,经双酶切后克隆到pPIC9k载体,构建pPIC9k-TH1-5表达载体。pPIC9K-TH1-5经PCR和测序验证正确后,分别用BglⅡ或SacⅠ酶切线性化,电击法转入Pichia pastoris GS 115,筛选出的阳性克隆(YH3)经甲醇诱导表达,诱导上清冷冻干燥后-80℃保存。(2) Dot-ELISA检测THl-5方法的建立TH1-5合成肽为标准品(阳性对照)、自制兔抗TH1-5抗体为一抗、HRP-羊抗兔IgG为二抗,建立检测TH1-5的Dot-ELISA法,其中一抗最佳稀释度为1：50,二抗最佳稀释度为1：200。通过建立的Dot-ELISA法检测到YH3的表达上清中含有TH1-5。(3)重组表达TH1-5对病原菌和鸡外周血淋巴细胞的影响含重组表达TH1-5的YH3表达上清(简称TH1-5上清)对大肠杆菌(CMCC44102)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、绿脓假单胞菌(ATCC27853)、粪肠球菌(ATCC29212)具有明显的抑菌活性。TH1-5上清单独作用于鸡外周血淋巴细胞,可促进淋巴细胞的增殖,但与对应浓度的空载体(PO)表达上清比较差异不明显。0.2～1.6 mg/mL的TH1-5上清与0.125μg/mL的ConA共刺激鸡外周血淋巴细胞,显示出比相应浓度空载体(P0)表达上清更强的协同促进增殖效应。本研究成功构建了pPIC9k-TH1-5表达载体,获得分泌表达TH1-5的毕赤酵母工程菌,并建立了检测重组TH1-5的Dot-ELISA法。重组表达的TH1-5具有抗菌活性和协同ConA促进鸡外周血淋巴细胞增殖的作用。
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