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目的:探讨EphB受体在吗啡依赖和戒断形成中的作用以及吗啡依赖和戒断的细胞和分子机制。
方法:昆明小鼠(体重20～22g,n=329)和EphB1基因敲除(EphB1-/-)小鼠(n=10)、野生型CD-1小鼠(n=10)用于本实验研究。昆明小鼠分为五组:空白组、依赖组、戒断组、给药组及对照组。空白组,不给任何处理;依赖组,吗啡七次递增给药建立吗啡依赖模型;戒断组,吗啡依赖模型最后一次给吗啡后2 h,皮下注射(s.c.)纳洛酮(1 mg/kg)诱发戒断;给药组,依赖模型小鼠或戒断模型小鼠鞘内单次或七次注射EphB受体抑制剂EphB2-Fc(单次注射,2μg;多次注射,1μg);鞘内注射(i.t.)溶媒PBS或抑制剂对照IgG-Fc,设立对照组。①观察小鼠戒断30 min内行为学反应,考察戒断给药组和戒断组行为学反应差别;同时,采用热板法测定i.t.EphB受体抑制剂或IgG-Fc对于小鼠痛阈和吗啡镇痛效果的影响;②采用免疫组织荧光染色的方法,检测给药组相对于依赖组和戒断组脊髓背角。Fos基因编码的蛋白(c-Fos)以及降钙素基因相关肽(CGRP)的变化。③采用蛋白印迹分析方法测定、比较依赖组和戒断组相对于空白组脊髓EphB1、ephrinB1、ephrinB2蛋白及ephrinBs磷酸化水平的高低,并测定、比较各组脊髓N-甲基D-天冬氨酸受体(NMDARs)的NR2B亚单位、细胞外信号调节激酶(ERK)和cAMP效应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化水平变化;④观察EphB1基因敲除小鼠和对应野生型小鼠戒断30 min内行为学反应差别,探究EphB1受体亚型对吗啡依赖和戒断产生和维持的作用。
结果:
①与戒断组比较,给药组小鼠鞘内注射EphB受体抑制剂可减轻戒断小鼠的戒断行为学反应(p＜0.05),并且鞘内注射EphB受体抑制剂或IgG-Fc对小鼠痛阈和吗啡镇痛效果均无影响(p＞0.05);
②依赖组和戒断组相较于空白组,小鼠脊髓背角部位c-Fos增多(p＜0.01);依赖组相较于空白组CGRP光密度升高,而戒断组相较于依赖组CGRP降低(p＜0.01),而鞘内注射EphB受体抑制剂可抑制c-Fos诱导增加(p＜0.05)和依赖组CGRP的升高及戒断组的降低(p＜0.05);
③与空白组比较,依赖组和戒断组脊髓EphB1蛋白水平升高(p＜0.01),并且鞘内注射EphB受体抑制剂可抑制EphB1受体水平的升高(p＜0.05或p＜0.01);与空白组比较,依赖组和戒断组ephrinB1、ephrinB2蛋白及ephrirnBs磷酸化水平均无明显改变(p＞0.05);
④与空白组比较,依赖组和戒断组脊髓背角NR2B、ERK、CREB磷酸化水平升高(p＜0.05或p＜0.01),而i.t.EphB受体抑制剂可抑制这些蛋白磷酸化水平的上调(p＜0.05或p＜0.01);⑤与野生型小鼠(WT)相比,EphB1基因敲除小鼠的戒断行为学反应减轻(p＜0.01)。
结论:
①脊髓水平EphB受体参与调控吗啡依赖及戒断反应的产生和发展;
②该作用可能是通过与NMDA受体的NR2B亚单位相互作用从而影响其下游细胞内信号通路而实现的;
③EphB家族中的EphB1受体亚型在吗啡依赖和戒断反应中起重要作用。