目的:　　[1]根据本室已完成的预测信息，筛选三个富含T细胞和B细胞的Her-2/neu表位，构建以pET21a-HBcAg(MIR)为载体的多表位串联重组质粒（含六个组氨酸标签-His.tag），并在原核系统进行重组蛋白的表达和鉴定;　　[2]对pET21a-HBcAg(MIR)-Her-2多表位串联蛋白的免疫原性进行研究，包括细胞免疫和体液免疫，并对MIR-Her-2/neu-Epi1和MIR-Her-2-Epi1/Epi2/Epi3两个重组蛋白的免疫原性差异性进行分析;　　[3]合成第三个表位肽，检测乳腺癌病人抗-Her-2/neu自身抗体水平，对筛选的三个表位的免疫特异性进行研究。　　方法：　　[1] PCR扩增出Her-2/neu表位基因，连接到载体Pet21a-HBc(MIR)上构建重组质粒Pet21a/HBcAg(MIR)-Epi1、Pet21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3，质粒构建成功后，送测序，将测序结果正确的两个重组质粒及载体pET21a/HBc转化入表达载体EcoiBL21菌株中，IPTG诱导表达，SDS-PAGE、Wb鉴定，处理包涵体，经Ni-NTA亲和层析法纯化，并对纯化蛋白进行复性;　　[2]选取6～8周龄的BALB/c雌性小鼠，随机分为4组，每组6只。4个组别分别为PBS、载体蛋白Pet21a-HBc(MIR)、重组蛋白Pet21a/HBcAg(MIR)-Epi1和重组蛋白Pet21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3组，其中，PBS和载体蛋白Pet21a-HBc(MIR)组为阴性对照。用各重组蛋白于1、3、5w背部皮下多点注射免疫各对应组小鼠，共免疫3次，PBS组注射等量PBS。免疫前一周即0w开始，行小鼠断尾取血，后隔周一次，一共采集5次。酶联免疫吸附(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)检测血清Her-2/neu特异性IgG;末次采血后，即免疫第8周，无菌取小鼠脾细胞，用Her-2/neu CTL合成肽(Epi1上的一段9个氨基酸短肽，序列为KIFGSLAFL)刺激，P815细胞（小鼠肥大细胞）作为靶细胞，设置40∶1、20∶1、10∶1三个不同的效靶比，用LDH法检测小鼠脾细胞的CTL杀伤活性;　　[3]收集乳腺癌病人、乳腺纤维腺瘤和乳腺囊肿和正常人血清标本。合成三Her-2/neu表位肽，并将这三个表位肽作为包被抗原，再采用ELISA方法检测各组血清标本抗-Her-2/neu特异性IgG抗体水平。　　结果：　　[1]成功构建了Her-2/neu串联表位重组质粒pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3。经SDS-PAGE和WB分析，重组蛋白pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3及载体蛋白pET21a/HBcAg(MIR)均在原核系统内得到了高效表达，Ni-NTA亲和层析法得到了条带单一的纯化蛋白;　　[2]免疫原性检测　　体液免疫:ELISA结果显示:Her-2/neu重组蛋白免疫能刺激机体产生较高水平的的Her-2特异性IgG，随着免疫次数的增加抗体水平持续上升，至第六6周达到高峰。第6周时，单因素方差分析比较各组间IgG抗体水平差异，组间(F=317.43,P＜0.01)。pET21a/HBcAg-MIR-Epi1(1.035±0.111)组IgG抗体水平明显高于PBS组(0.134±0.02和pET21a/HBcAg-MIR对照组(0.241±0.04)(T1=7.521,P＜0.01;T2=5.692,P＜0.05pET21a/HBcAg-MIR-Epi1/Epi2/Epi3组(1.137±0.0680)也明显高于PBS组(0.134±0.025)和pET21a/HBcAg-MIR对照组(0.241±0.04)(T1=5.292，P＜0.01;T2=8.836，P＜0.01);pET21a/HBcAg-Epi1/Epi2/Epi3组较MIR-Epi1组高，差异具有统计学意义(T=1.47，P＞0.05);　　细胞免疫:用LDH法检测小鼠脾细胞CTL细胞杀伤活性，结果显示，在效靶比为20∶1时，小鼠脾细胞CTL杀伤效率最高，单因素方差分析，F=547.843，＜0.001。PBS组(4.882％±0.81％)的杀伤率最低，pET21a/HBcAg-MIR体对照组(6.332％±1.032％)的杀伤效率也很低仅高于PBS组;pET21a/HBcAg-MIR-Epi1/Epi2/Epi3组(34.97500％±1.407％)的杀伤率最高pET21a/HBcAg-MIR-Epi组(30.992％±0.601％)次之。经统计学分析，pET21a/HBcAg-MIR-Epi1组的杀伤效率明显高PBS组和pET21 a/HBcAg-MIR载体对照组(T1=9.782，P＜0.01;T2=7.619，P＜0.01)，MIR-Epi1/Epi2/Epi3组显著高于PBS组和MIR载体对照组(T1=5.478，P＜0.01;T2=3.653，P＜0.01)，MIR-Epi1/Epi2/Epi3组高于pET21a/HBcAg-MIR-Epi1组，(T=2.547，P＜0.05);　　[3]用ELISA法检测病人血清标本抗-Her-2自身抗体水平，结果显示:乳腺癌病人抗-Her-2/neu自身抗体水平较高，疾病对照组次之，正常人最低。经统计学分析，肽1孵育时:乳腺癌病人组(0.965±0.092)血清特异性抗提水平明显高于乳腺纤维腺瘤组(0.505±0.055)和正常人组(0.476±0.05(T1=6.424，P＜0.05，T2=3.881，P＜0.05)，乳腺纤维腺瘤组(0.505±0.055)和正常人组(0.476±0.054)血清特异性抗体水平差异无统计学意义。(T=0.987，P＞0.05);肽2孵育时:乳腺癌病人组(0.915±0.081)血清特异性抗提水平明显高于乳腺纤维腺瘤组(0.526±0.061)和正常人组(0.427±0.043)，(T1=7.544，P＜0.05;T2=4.172，P＜0.05)，乳腺纤维腺瘤组(0.526±0.061)和正常人组(0.427±0.043)血清特异性抗体水平差异无统计学意义(T=1.465，P＞0.05);肽3孵育时:乳腺癌病人组(0.922±0.076)血清特异性抗提水平明显高于乳腺纤维腺瘤组(0.563±0.087)和正常人组(0.4430±0.048)(T1=6.038，P＜0.05;T2=4.281，P＜0.05)，乳腺纤维腺瘤组和正常人组血清特异性抗体水平差异无统计学意义(T=0.548，P＞0.0S)。肽1孵育乳腺癌病人组、肽2孵育乳腺癌病人组、肽3孵育乳腺癌病人组之间差异无统计学意义(F=5.883，P＞0.05)。　　同时，计算了各组病人Her-2阳性人数和阳性率，乳腺癌病-Her-2/neu自身抗体水平较高，疾病病对照组次之，正常人最低。肽1孵育:乳腺癌病人组血清抗体阳性率(42.708％)明显高于正常人组(2.083％)和乳腺纤维腺瘤组(6.25％)和(T1=18.475，P＜0.001; T2=14.336，P＜0.001)，正常人组(2.083％)乳腺纤维腺瘤疾病对照组(6.25％)差异无统计学意义(T=3.422，P＞0.05).。肽2孵育:乳腺癌病人组血清抗体阳性率(42.708％)明显高于正常人组2.083％和乳腺纤维腺瘤组7.143％(T1=17.472，P＜0.001;T2=14.336，P＜0.001)，正常人组(2.083％)和乳腺纤维腺瘤疾病对照7.143％差异无统计学意义(T=3.825，P＞0.05)。肽3孵育:乳腺癌病人组血清抗阳性率(41.667％)明显高于正常人组(1.389％)和乳腺纤维腺瘤疾病对照组(6.25％)(T1=17.472，P＜0.001; T2=14.336，P＜0.001)，正常人组(1.389％)和乳腺纤维腺瘤疾病对照组(6.25％)差异无统计学意义(T=1.974，P＞0.05)。3个肽组进行了组间差异分析，无统计学意义(F=20.543，P＞0.5)。　　结论:　　[1]成功构建了重组质粒pET21a/HBcAg-Epi1、pET21a/HBcAg-Epi1/Epi2/Epi3，重组蛋白原核系统表达量高;　　[2] pET21a/HBcAg(MIR)-Her-2串联表位蛋白可诱导小鼠产生血清特异性的抗-Her-2IgG抗体，可以有效刺激小鼠脾细胞产生特异性的CTL反应，具有较强的免疫原性。且pET21a/HBcAg(MIR)-Her-2串联表位蛋白比单表位蛋白的免疫原性强;　　[3]用Her-2表位肽检测乳腺癌病人抗-Her-2特异性IgG抗体水平，显著高于疾病对照组和正常人组，为乳腺癌病人Her-2表达情况的鉴定提供了新的筛查方法。