本文根据survivin基因高表达于各类型淋巴瘤组织和淋巴瘤/白血病细胞株的特性，采用化学合成siRNA(smallinterferenceRNA)法和短发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)载体表达技术，构建了pSilencerTM4.1neo-CMV-Survivin-shRNA重组质粒并通过脂质体转染至多株人淋巴瘤/白血病细胞系，观察Survivin表达沉默对淋巴瘤/白血病细胞包括细胞凋亡、增殖和化疗药物药敏性等在内生物学特性的影响，初步探讨Survivin基因在淋巴瘤/白血病作用机制及其在肿瘤基因靶向治疗中的意义。 一RNA干扰应用于淋巴瘤/白血病肿瘤基因研究的靶基因筛选 目的免疫组织芯片检测抗凋亡基因肿瘤凋亡相关基因等在淋巴瘤/白血病组织中表达情况，探讨它们与淋巴瘤/白血病的相关性，拟筛选出RNA干扰最适合的靶基因。 方法收集190例石蜡包埋非霍奇金淋巴瘤(NHL)组织，10例淋巴结反应性增生组织、淋巴瘤/白血病细胞系Jurkat、Raji、Daudi，采用免疫组化SP方法和RT-PCR方法检测抗凋亡基因Survivin、BCL-2、Bcl-xl、P53、P73、P63、mdm2、P21等在淋巴瘤组织和淋巴瘤/白血病细胞系的表达情况。 结果免疫组化结果显示，上述抗凋亡基因中Survivin在190NHL组织阳性表达率最高，为77.36％(148/190)，Survivin表达与B-NHL侵袭性正相关；在高度恶性造血系统肿瘤细胞系Jurkat、Raji、Daudi细胞中呈强阳性表达；在正常人外周血淋巴细胞不表达。 结论Survivin在NHL高表达，提示干扰其表达可产生较强的细胞生物学特性改变，是RNA干扰用于淋巴瘤/白血病肿瘤基因研究的一个潜在靶点。 二RNA干扰Survivin基因在淋巴瘤/白血病细胞中的表达 目的通过shRNA载体表达技术，构建了pSilencerTM4.1neo-CMV-Survivin-shRNA重组质粒，建立瞬时和稳定表达Survivin-shRNA的淋巴瘤/白血病细胞系。 方法和结果1构建重组shRNA表达载体从大肠杆菌DH5α提取表达载体pSilencer4.1-CMVneoDNA。 2成功筛选出了携带G418抗性重组pSurvivin-shRNA表达载体的Jurkat、Raji、Daudi细胞株。 3瞬时和稳定转染Jurkat、Raji、Daudi细胞SurvivinmRNA和蛋白表达水平相对于PBS处理组和pControl-shRNA处理组均有明显下降，表达抑制率为60-70％。 结论RNA干扰技术是一种快速、简便、高效的基因沉默工具。 三RNA干扰survivin表达对淋巴瘤/白血病细胞生物学特性影响目的探讨RNA干扰使Survivin表达下调后对淋巴瘤/白血病Jurkat、Raji、Daudi细胞系包括细胞凋亡、增殖在内等细胞生物学特性的影响。 方法和结果1RNA干扰survivin表达对细胞凋亡水平的影响流式细胞仪结果显示，与Control-shRNA和PBS处理组相比，瞬时转染组和稳定转染组细胞均出现明显的细胞凋亡锋；转染组细胞与两对照组比较统计学分析有显著性差异(P＜0.05)；瞬时转染组凋亡指数(apoptosisindex，AI)与稳定转染组之间AI比较统计学分析无显著性差异。 2RNA干扰survivin表达对稳定转染细胞系生长增殖状态的影响生长曲线显示，与Control-shRNA和PBS处理组细胞相比，Survivin-shRNA稳定转染组细胞的生长曲线明显压低，细胞生长趋势显著减慢。 3RNA干扰survivin表达对稳定转染细胞倍增时间的影响与PBS和Control-shRNA处理组两对照组相较，各株稳定转染Survivin-shRNA细胞的倍增时间明显延长，分别为Jurkat：55.41±3.74h，Raji：60.75±2.38h，Daudi：58.16±1.96h，统计学分析差异有显著性(*P＜0.05)结论RNA干扰survivin表达能有效地抑制瞬时和稳定转染细胞SurvivinmRNA和蛋白水平的表达、显著增加细胞凋亡率(AI)，细胞生长趋势明显放慢、细胞倍增时间延长；结果提示Survivin的异常表达与淋巴瘤/白血病细胞增殖、抗凋亡活性密切相关，Survivin直接负性调控淋巴瘤/白血病细胞的凋亡并促进细胞增殖，表明Survivin有可能成为一个具有潜在应用价值的淋巴瘤/白血病肿基因治疗靶点。 四RNA干扰Survivin表达对淋巴瘤/白血病细胞相关基因表达的影响目的通过已建立的稳定转染Survivin-shRNA淋巴瘤/白血病细胞系，研究RNA干扰Survivin对淋巴瘤/白血病细胞多个相关基因表达的影响，进一步探讨Survivin在淋巴瘤/白血病细胞发生、发展中与相关基因相互作用的分子机制。 方法和结果Westernblot检测稳定转染细胞Survivin表达下调后对多个与Survivin相关基因包括P53，Bcl-2，Bcl-xl，Caspase-3，Caspase-9蛋白表达水平的影响。结果显示，与Control-shRNA处理组和PBS处理组比较，稳定转染组细胞Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达量统计学分析无显著性差异；Caspase-3、Caspase-9和p53蛋白表达量显著上调，上调率分别为58.49％、40.25％和38.67％，统计学分析差异有显著性(P＜0.05)。 结论1实验结果提示，癌基因Survivin可能通过直接抑制caspase-3、caspase-9等活性阻遏多个凋亡信号通路诱导的细胞凋亡。 2.RNA干扰抑制Survivin表达后野生型P53基因的表达有所增加，提示了淋巴瘤/白血病细胞存在P53突变可能使野生型P53对抗凋亡基因Survivin的负性调控功能下降或丧失，导致Survivin过度表达；而Survivin过表达又可能对野生型P53起到一定程度负反馈调节作用，进一步抑制野生型P53发挥其正常功能。 3.实验结果提示，Survivin基因与BCL-2基因家族可能是分别通过不同的信号传导通路负性调控细胞凋亡的，它们之间可能不存在直接的相互作用。 五RNA干扰Survivin表达对淋巴瘤/白血病细胞抗肿瘤药物敏感性的影响 目的观察RNA干扰淋巴瘤/白血病细胞株Survivin表达后肿瘤细胞对化疗药物敏感性的影响，探讨肿瘤基因靶向治疗与化疗药物联合治疗的效果。 方法与结果1MTT检测稳定转染Survivin-shRNA前后Daudi细胞对化疗药物的敏感性相同剂量的抗肿瘤药物阿霉素(ADM)、4-羟基-环磷酰氨(CTX)、长春新碱(VCR)、甲氨蝶呤(MTX)对稳定转染Survivin-shRNADaudi细胞的生长抑制率明显大于PBS和Control-shRNA处理组，表明稳定转染Daudi细胞对化疗药物的敏感性较转染前(PBS处理组)和转染无功能shRNA(Control-shRNA)对照组显著提高。 2不同浓度阿霉素(ADM)对Survivin-shRNA稳定转染前后Daudi细胞Survivin表达水平的影响 三个药物浓度0ug/ml，0.50ug/ml，5.0ug/mlADM作用于PBS处理组、Control-shRNA处理组和稳定转染Survivin-skRNA细胞48h，Westernblot方法检测三组细胞Survivin蛋白表达水平。结果显示，低浓度(0.50ug/ml)和高浓度(5.0ug/ml)ADM处理48h后PBS处理组、Control-shRNA处理组和稳定转染细胞Survivin的蛋白表达水平较未经ADM处理组均有下调；高浓度ADM较低浓度ADM处理组Survivin蛋白表达水平的下调更为明显，其中高浓度5.0ug/mlADM作用48h后稳定转染细胞的Survivin蛋白表达水平几乎完全抑制。 3不同浓度阿霉素(ADM)对Survivin-shRNA稳定转染前后Daudi细胞的凋亡水平的影响： 选用0ug/ml，0.50ug/ml，5.0ug/mlADM分别作用于PBS处理组、Control-shRNA处理组和稳定转染Survivin-shRNA的Daudi细胞，48h后在流式细胞仪上检测三组细胞的凋亡水平。FCM结果显示，低浓度(0.50ug/ml)和高浓度(5.0ug/ml)ADM作用48h后三组细胞凋亡水平较未经ADM(0ug/ml)作用组均有上调，其中，ADM与Survivin-shRNA联合作用组细胞的凋亡水平较PBS处理组、Control-shRNA处理组有显著提高；高浓度(5.0ug/ml)ADM与Survivin-shRNA联合作用组细胞的凋亡水平更高，达89.70±4.71％。 结论1.Survivin-shRNA能增加Daudi细胞对常用抗肿瘤药物ADM、CYX、MTX、VCR的敏感性，明显增强抗肿瘤药物对细胞的杀伤作用。 2.ADM可能通过抑制抗凋亡基因Survivin在肿瘤细胞的表达而起抗肿瘤效应的。3.RNA干扰与化疗药物联合应用的抗肿瘤效应较两者单独使用的效果更为明显，提示RNA干扰基因靶向治疗与常规化疗手段相结合很有可能成为将来抗肿瘤治疗的一个新策略。