论文部分内容阅读
目的:结肠癌(colorectal carcinoma)作为消化系统的恶性肿瘤,发病率之高严重威胁人类健康,研究表明其发病机制与癌基因和抑癌基因的表达失调有关。随着近年来对抗肿瘤药物的不断研发,基因治疗已经成为一个研究热点,大量针对新作用靶点的抗肿瘤基因药物被逐渐发现并应用于临床试验中,其中G-四链体结构是近年来人们关注的重点研究对象之一。G-四链体(G-quadruplex)由富含鸟嘌呤的核酸序列旋聚而成,基因启动区和端粒末端可以形成G-四链体结构,部分小分子药物可以结合和稳定G-四链体结构,抑制相关癌基因表达和端粒酶活性从而抑制肿瘤生长。原癌基因c-myc启动子区的核酸超敏元件Ⅲ1(NHEⅢ1也叫Pu27)富含鸟嘌呤可以形成分子内G-四链体结构从而沉默c-myc基因表达。富含鸟嘌呤寡核苷酸序列(oligonucleotides with guanosine-rich sequences)可以形成G-四链体结构,对于大部分肿瘤细胞,一些GRO(G-rich oligonucleotide)表现出高效增殖抑制作用的同时降低了对正常细胞的毒性作用,逐渐成为抗肿瘤治疗的新型核酸药物。Pu27序列可以在体外形成G-四链体,通过非转染方式进入白血病细胞,稳定c-myc基因启动子区形成的G-四链体结构,下调c-myc基因表达抑制增殖,具有抗核酸酶及无需介导直接进入细胞等其他传统大分子抗癌药物(如反义寡核苷酸等)所不具备的优点。观察体外Pu27和突变体Mut Pu27序列对结肠粘膜正常上皮细胞FHC及结肠癌细胞HCT-116、SW480、SW620增殖与凋亡的影响;观察体外Pu27和突变体Mut Pu27序列对结肠粘膜正常上皮细胞FHC及结肠癌细胞HCT-116、SW480、SW620原癌基因c-myc表达的影响;初步研究分析体外Pu27序列抑制肿瘤增殖和基因表达的可能分子机制。方法:(1)阅读文献并选出核酸类抗癌药物Pu27序列和特异G碱基突变序列Mut Pu27并合成;(2)以人结肠癌细胞株HCT-116、SW480、SW620和结肠粘膜正常上皮细胞FHC为实验对象,寡核苷酸序列Pu27和Mut Pu27以非转染方式进入细胞并发挥作用,设立HCT-116/Pu27组、HCT-116/Mut Pu27组、SW480/Pu27组、SW480/Mut Pu27组、SW620/Pu27组、SW620/Mut Pu27组、FHC/Pu27组和FHC/Mut Pu27组;(3)提取上诉各个分组细胞的m RNA和蛋白,荧光实时定量PCR和Western blotting技术检测c-myc基因表达水平;FHIC标记Pu27、Mut Pu27序列观察细胞的摄取以及在细胞中的稳定情况。结果:(1)MTT实验和流式细胞术检测结果表明,Pu27序列对三种不同结肠癌细胞有不同程度的抑制增殖作用,其中SW480细胞组敏感性最高,可以促进细胞凋亡,差异有统计学意义(P<0.05);(2)RT-PCR和Western blotting检测表明,Pu27序列下调c-myc基因表达水平,三种不同结肠癌细胞中SW480细胞组敏感性最高,差异有统计学意义(P<0.05);(3)细胞摄取实验结果显示Pu27通过非转染途径在短时间内进入细胞且一定时间内稳定存在于细胞中。结论:外源性Pu27寡核苷酸序列通过非转染方式直接进入细胞,与正常上皮细胞FHC组相比,抑制HCT-116、SW480结肠癌细胞的体外增殖并诱导凋亡,下调c-myc基因表达,其中对SW480细胞的作用更为显著,提供了结肠癌基因治疗的新思路。