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研究背景骨肉瘤是高度恶性骨肿瘤,多见于儿童和青少年,临床治疗非常困难。尽管新辅助化疗明显提高了生存率,但近30年骨肉瘤的生存率没有得到进一步的提高,5年生存率和总的生存率一直徘徊在50-60%,单纯截肢患者常于一年内死于肺转移。已经有大量的学者对骨肉瘤发生、发展的分子机制进行了深入研究,这有助于更早、更准确的诊断,以及开发新的治疗方案。尽管对骨肉瘤的分子机制的理解正在逐渐加深,但其复杂的分子机制仍然没有得到很好的了解。microRNA (miRNA,小RNA)是内源性,非编码,单链RNA,长度为19-25个核苷酸,通过促进靶mRNA降解或抑制靶mRNA水平的蛋白质翻译而在转录后水平负调控基因的表达,具有广泛的生物学效应。越来越多的资料显示miRNA参与肿瘤的发生发展,其表达谱可用于肿瘤的早期诊断,肿瘤分型并可判断肿瘤的预后以及对特定治疗方案的敏感性,甚至可以作为有效的治疗靶点。而且已经有研究发现骨肉瘤中miRNA表达谱的改变。但这些改变的miRNA表达谱对骨肉瘤的影响和意义及其内在的调控靶基因尚未进行深入的研究。因此很有必要对骨肉瘤细胞中的miRNA进行更进一步的研究。已经发现多种肿瘤中miR-27a表达升高,具有促进肿瘤的作用,而且骨肉瘤中miR-27a的表达也是升高的,但其作用机制仍不明确,本研究拟通过体外试验来明确miR-27a在骨肉瘤细胞中的作用并探讨其作用机制。研究目的1.探讨MAP2K4与miR-27a之间的靶向关系。2.构建miR-27a特异性抑制剂转染骨肉瘤细胞株MG63细胞,明确miR-27a对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的影响。3.通过Western blotting检测JNK/p38信号通路上关键蛋白的表达水平的改变,探讨miR-27a在骨肉瘤发生发展上的分子机制。研究方法通过生物软件预测miR-27a的靶基因,构建靶基因报告载体,转染骨肉瘤细胞后进一步验证miR-27a对靶基因MAP2K4的调节作用。体外培养骨肉瘤细胞株MG63,处理组和阴性对照组分别转染miR-27a特异性抑制剂及阴性对照抑制剂,通过MTT法、集落形成试验、小室迁移试验等检测其对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭等细胞行为的影响来明确miR-27a在骨肉瘤细胞中的作用。并通过Western blotting检测JNK/p38信号通路上关键蛋白的表达水平的改变。研究结果1. MAP2K4是miR-27a的一个靶基因用三大常用的miRNA数据库TargetScan、miRBase和Pictar来预测miR-27a的目标基因。结果检测到MAP2K4mRNA的3’UTR有两个可能的结合部位。将MAP2K4的3’UTR序列克隆到pGL3载体,位于萤光素酶报告基因的下游。同时构建了预测结合部位突变的阴性对照。野生型pGL3-MAP2K43’UTR载体的萤光素酶活性明显降低,而突变型的萤光素酶活性则无明显降低。同时转染miR-27a抑制剂或阴性对照+野生型pGL3-MAP2K43’UTR载体到MG63细胞抑制miR-27a增加萤光素酶活性。2.抑制miR-27a后可以抑制MG63的增殖MTT检测发现转染72小时后,miR-27a抑制剂较阴性对照组可以显著抑制MG63细胞的增殖。MG63细胞所形成的集落较阴性对照组少了39.6%。3.抑制miR-27a后可以抑制MG63细胞的迁移和侵袭能力小室迁移和侵袭实验显示转染了miR-27a抑制剂后MG63的转移和侵袭能力分别减少了63.5%和69.1%。4.抑制MG63中miR-27a后能增加激活.JNK/p38信号通路将miR-27a抑制剂或阴性对照转染MG63细胞,结果显示转染miR-27a抑制剂的MG63细胞中MAP2K4蛋白表达水平提高的同时,JNK1和p38的磷酸化水平也分别上升了25%和29%。结论本研究发现MAP2K4是miR-27a的功能靶基因,抑制骨肉瘤细胞中的miR-27a可以提高MAP2K4的蛋白表达水平,通过激活JNK/p38信号通路抑制骨肉瘤细胞MG63的增殖、迁移和侵袭性能力。