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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是老年人常见的神经系统变性疾病,发病机制不明确,年龄、氧化应激和线粒体功能异常是重要的致病因素。胰岛素在中枢神经系统作为一种神经营养因子,能够保护神经元免遭氧化应激损害。PD患者可能存在中枢胰岛素—胰岛素信号通路的异常。本课题组已经在PC12细胞中开展了对胰岛素-胰岛素受体信号转导通路的研究,初步证实胰岛素通过激活胰岛素受体和下游的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3’-OH kinase,PI3-K),抵抗神经毒物1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶离子(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinium iodide,MPP~+)诱导对PC12细胞的凋亡,保护多巴胺能神经元。本课题将进一步探讨胰岛素激活后,对下游信号级联的影响,以及其细胞保护的可能机制。第一部分胰岛素增强PC12细胞对MPP~+的抵抗目的观察胰岛素处理是否减轻MPP~+诱导的PC12细胞凋亡,探讨可能的机制。材料与方法测定不同处理后PC12细胞的存活和细胞凋亡情况,观察胰岛素处理对细胞内信号蛋白激酶B(protein kinase B,也称为Akt)、糖元合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)和微管相关蛋白tau磷酸化的影响。结果胰岛素预处理能保护细胞,增加撤除血清后细胞的活力(P＜0.001);增强PC12细胞对100μmol/L MPP~+毒性的耐受(P=0.04),这一作用可以被Akt抑制剂—LY294002阻断。HOECHEST染色和流式细胞检测显示,胰岛素干预减少细胞凋亡。100nmol/L胰岛素处理细胞,Akt ser-473磷酸化程度升高(P=0.008);GSK3βser-9磷酸化增强(P=0.005)。胰岛素干预,减少tau pS199过磷酸化,而不改变tau pT231的磷酸化。结论胰岛素通过其细胞内信号通路,调节Akt/GSK3β的磷酸化,减轻MPP~+诱导的PC12细胞凋亡。第二部分α突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及PC12细胞的转染目的建立α突触核蛋白野生型和突变体的慢病毒表达质粒,并在包装细胞中合成和收获病毒,转染PC12细胞,建立稳定的转染细胞株。材料与方法抽提人脑总RNA,RT-PCR法扩增α-synuclein cDNA,连接构建SNCA-WT的pDrive穿梭质粒。设计含酶切位点的上下游引物,将扩增的PCR产物和pLenti6/V5-LacZ进行PstⅠ,XhoⅠ双酶切,酶切产物以T4连接酶连接,将编码人野型α-SYN和突变型的α-SYN基因A30P、A53T克隆入表达载体。转化后挑选正确的克隆酶切和测序,鉴定鉴定构建的表达载体正确性。以脂质体转染法将野生型或突变型α-SYN和包装质粒共同转染293FT细胞(以LacZ表达质粒为阳性对照),72h后收获病毒离心过滤,超速离心将沉淀重悬得到病毒储存液,分别转染PC12细胞。利用western-blot和免疫细胞化学法鉴定α-SYN的表达。结果经酶切和测序鉴定,pLenti6/V5-α-synuclein序列正确,与病毒标志肽段V5融合表达。经293FT细胞包装后收获了病毒储存液,转染PC12细胞。经western-blot和免疫细胞化学法鉴定,转染细胞稳定表达野生型和突变型的α-SYN。结论:构建了α-SYN慢病毒表达质粒,并成功转染PC12细胞,形成稳定表达野生型或突变型的PC12细胞。第三部分胰岛素对转染α-突触核蛋白的PC12细胞的调节目的观察胰岛素干预是否减轻神经毒物对转染α-突触核蛋白(α-synuclein)野生型或突变型的PC12细胞的损害,探讨可能的机制。材料与方法MTT法测定野生型或突变型PC12细胞在MPP~+和6-OHDA处理的存活情况,胰岛素干预对其活力的调节。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。MICE法观察胰岛素处理对细胞Akt、GSK3β和tau磷酸化的作用。免疫细胞化学法检测不同处理tau磷酸化改变。结果MTT法测定野生型和突变型PC12细胞在正常生长条件下,细胞增殖能力相似。MPP~+或6-OHDA处理24小时后各组细胞活力均降低,以A30P和A53T转染的细胞损害最严重。100nM胰岛素干预能增加转染野生型人α-synuclein(WT)、α-synuclein突变体A30P、A53T的PC12细胞在MPP~+条件下的存活(P＜0.05),LY294002能够阻断胰岛素的保护作用。胰岛素孵育能增强转染细胞Akt pS473位点磷酸化,但突变型细胞内GSK3β、tau pS199、tau pT231磷酸化无改变。MPP~+和抑制蛋白降解的共同作用下,细胞内出现硫黄素S染色阳性的颗粒。结论转染α-突触核蛋白不影响PC12细胞的存活,但转染细胞,特别是突变型细胞降低对MPP~+的耐受。胰岛素可能通过促使转染细胞Akt pS473磷酸化,减轻MPP+诱导的细胞凋亡。胰岛素对突变型转染细胞GSK3β磷酸化作用不明显,可能导致细胞对神经毒物的耐受性比较弱。结论1.胰岛素减少神经毒物MPP~+诱导的转染或未转染α突触核蛋白的PC12细胞的凋亡。2.胰岛素对细胞的保护作用与Akt-GSK3β信号通路的激活有关。3.转染SYN,特别是突变体的PC12细胞,对神经毒物更易感。