论文部分内容阅读
脂肪组织不仅和人体的脂质代谢密切相关,而且它还作为一个分泌组织参与人体的内分泌调控。目前已经证明脂肪细胞的分化与糖、脂代谢及机体能量平衡关系密切,其调控失常与人类多种疾病如肥胖症、糖尿病、脂肪肝、高脂血症及乳腺癌等密切相关。DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要形式,研究表明其参与调控了脂肪细胞的分化。因此,研究DNA甲基化调控脂肪细胞分化关键基因的相关机制,对探讨相关疾病有重要意义。 本研究采用3T3-L1脂肪细胞,初步探讨了DNA甲基化对分化关键基因C/EBPα的转录调控。首先采用BSP法检测C/EBPα基因启动子区+5bp—+148bp区域DNA甲基化水平,结果显示成熟脂肪细胞C/EBPα启动子该区域的DNA甲基化水平较未分化时无显著差异。而本实验室前期研究结果表明,成熟脂肪细胞C/EBPα启动子-140bp-290bp区域的DNA甲基化水平显著高于未分化时的状态,其中转录抑制因子Sp1的结合位点及其附近位点甲基化水平改变显著,因此本研究将重点关注在这一区域。为了研究该区域的DNA甲基化状态变化是否影响Sp1的结合,构建了一个包含3个重复序列的荧光素酶报告质粒,每个重复序列均包含Sp1结合位点及其附近CpG位点在内,通过荧光素酶报告实验证明Sp1结合位点及其附近CpG位点发生甲基化后,Sp1对C/EBPα启动子的结合能力下调。进一步将Sp1进行RNA干扰,在成功干扰Sp1的细胞系中转染上述质粒,结果显示,由于Sp1结合位点及其附近CpG位点的甲基化状态改变造成的质粒转录活性差异减小约20％。以上实验初步证明,随着3T3-L1脂肪细胞的分化成熟,C/EBPα启动子区域甲基化水平升高,这可能抑制了转录抑制因子Sp1的结合,从而导致C/EBPα的表达上调。同时,运用该系统对已知有分化抑制作用并且能下调C/EBPα启动子甲基化水平的柳茶水提物SAW进行检测,结果显示SAW的确能下调C/EBPα启动子转录活性及该基因的转录表达。最后,采用BSP法对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中呈典型时序性表达的PAT家族主要成员Perilipin,ADRP和Tip47进行了甲基化状态分析,结果显示它们在脂肪细胞分化前后启动子区域并未发生明显的甲基化状态改变,提示其时序表达可能受其他机制的调控。 总之,本研究初步揭示了前脂肪细胞分化过程中C/EBPα基因表达的DNA甲基化调控的可能机制,为肥胖等代谢相关疾病的治疗提供新的靶标。