眼表包括健康的眼表上皮细胞和完整的泪膜。其中，眼表上皮细胞又包括角膜上皮细胞和结膜上皮细胞，二者的健康状态不仅可保障正常的眼表功能，还有维持完整泪膜的重要作用。通常，在外露的角膜上皮和结膜上皮表面被覆着薄层的泪膜。泪膜不仅构成眼球与外界环境的交界面而且还形成保护角膜和结膜的屏障。泪膜中适量的电解质、蛋白、黏液和磷脂等成分不仅可维持角膜的透明性，还可保证角膜上皮细胞和结膜上皮细胞的健康状态。当眼表遭到诸如：干燥、强光、严寒、机械性刺激、物理性损伤、腐蚀性化学伤以及细菌性、病毒性和寄生虫性的感染时，均可引起应激性的泪膜变化。此外，泪膜不仅对外源性的各类刺激产生应激性反应，还有维持眼表上皮细胞内源性需要的作用，而眼表上皮细胞的健康状态也可直接影响到泪膜的状态。所以泪膜的成分、结构和分泌量都受到多因素的影响。此外，泪膜所构成的稳定液体膜不但可保护、维持健康的角膜和结膜上皮细胞，而且还可确保透明角膜提供清晰的视光学区。 在人类眼表由于结膜的表面积为角膜表面积的17倍，当其受到物理或化学损伤时，不但严重破坏眼表上皮的完整性和分泌功能，还可造成结膜的粘连和瘢痕形成，从而造成眼表的严重损坏。目前，虽然有自体结膜移植、唇粘膜移植、异体羊膜移植等治疗方法的报告，但是自体结膜来源受限，唇粘膜和异体羊膜缺乏结膜组织的功能，效果欠佳。因此需要我们开发出一种在组织学形态及生物功能上都接近结膜组织的生物材料作为治疗眼表损伤的结膜移植替代物。 干细胞是一类存在于皮肤、骨髓、肝脏及中枢神经系统等许多组织中、并具有高度增殖潜能和无限自我更新能力的细胞亚群，能自我更新并长期维持组织结构的稳定性，体外培养条件下或创伤时被激活，并开始增殖、再生以重建组织，具有高度的增殖潜能。与其他组织的干细胞相似，表皮的角质形成细胞干细胞(keratinocytestemcells，KSC)不仅对于皮肤组织的自身稳定和创伤愈合具有重要作用，而且具有上皮性始祖细胞的功能。目前对KSC的研究已取得较大进展，表皮是一种分层、快速更新的组织，角质形成细胞(KC)的再生是由基底层内干细胞和短暂扩增细胞(transitamplifyingcells，TAC)两种增生细胞的特殊体系来完成的。此外，有学者报道：在外胚层器官发育过程中，皮肤的上皮细胞与眼表上皮细胞(结膜、角膜、泪腺等)均来源于同一胚层，具有高度的同源性。 基于上述，本研究进行了以下方面的工作：人皮肤干细胞体外诱导分化构建人工结膜的实验研究 目的：观察皮肤干细胞在结膜去细胞基质膜上的生长和分化情况，探讨利用皮肤干细胞及结膜去细胞基质膜构建人工结膜的可能性。 方法：将体外分离培养的1～2代人皮肤干细胞接种于人结膜去细胞基质膜上，在体外观察细胞的分化情况。标本分别行HE染色、人上皮细胞角蛋白K19单克隆抗体、结膜上皮细胞特异性标记蛋白K8抗体、K13抗体、MUC5A/C抗体免疫组化鉴定。 结果：皮肤干细胞在结膜去细胞基质膜等模拟的体外微环境下可形成类似结膜上皮细胞的复层增生，并有类结膜上皮细胞特异性标记蛋白表达，呈K8抗体、K13抗体、MUC5A/C抗体表达阳性。 结论：利用皮肤干细胞可在体外模拟的微环境下分化构建人工结膜，用于结膜移植眼表重建。 人工结膜组织生物学特性检测的实验研究 目的：检测经诱导分化后的类结膜上皮细胞中β-2-microglobulin、keratin13基因的表达及人工结膜组织中特异性蛋白(CK13、MUC5AC)的表达情况。 方法：试验组细胞以结膜上皮细胞为饲养细胞进行共培养，并设立空白对照组细胞培养相同时间，分别于第1、3、5、7日取各组细胞提取RNA进行实时RT-PCR定量检测各组β-2-microglobulin、keratin13基因的表达情况；并用免疫印记的方法检测体外构建人工结膜组织膜中是否有结膜特异性CK13及MUC5AC蛋白的表达。 结果：试验组细胞共培养3天后出现β-2-microglobulin、keratin13基因的表达，5、7天的表达量显著提高；经体外构建10天、20天的人工结膜都有与正常结膜组织相同的CK13和MUC5AC蛋白的表达。 结论：经本实验方法构建的人工结膜组织膜具有与正常结膜组织相似的分子生物学特性。 人工结膜体内移植的动物实验研究 目的：将人工结膜组织移植于试验动物眼表，观察移植后的人工结膜在动物体内的诱导、分化结果。 方法：新西兰白兔20只，随机分为4组，完全剪除右眼球结膜，并在上方巩膜处植入人工结膜组织，分布于1、2、3、4周后取移植的人工结膜组织行冰冻切片，标本分别行PAS染色、人结膜上皮细胞特异性标记蛋白K13抗体、MUC5A/C抗体免疫组化鉴定。 结果：体外移植后的人工结膜组织在移植2、3、4周有类结膜上皮细胞特异性标记蛋白表达，K13抗体、MUC5A/C抗体表达阳性，并在3、4周呈上皮细胞PAS染色阳性。 结论：利用皮肤干细胞与结膜去细胞基质膜共建的人工结膜组织，移植于动物体内后也能诱导分化为正常的结膜组织。