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背景与目的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一类具有塑料贴壁性,呈纤维状,具有自我复制,自我更新和多向分化潜能的非造血基质细胞,存在于机体的骨髓和大量的结缔组织中,是干细胞家族的重要成员。在体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪,软骨,骨,肌肉,肌腱,神经,肝,心肌,胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞,甚至其多向分化潜能在连续传代培养和冷冻保存后仍旧存在。MSC细胞的表面标记具有明显特征:高表达CD90,CD105,CD44,CD73,CD4等分子,不表达造血细胞表面标记CD34,CD45,CD11b,CD11c,CD14,CD19,CD86和MHC-Ⅱ类分子。因此,我们可根据MSC细胞的这些特性来有效的判断其在体外培养之后的纯度,以此来指导我们对MSC细胞的研究。另外,不论是自体还是同种异体的MSC细胞均不会引起宿主细胞的免疫反应,即间充质干细胞的低免疫原性,这一特性使其应用于细胞治疗方面的研究成为可能。近年来,MSC细胞抑制同种异体T淋巴细胞活化和增殖的免疫调节作用也被不断证实:有学者认为MSC细胞可释放可溶性细胞因子而发挥免疫抑制作用;也有研究发现MSC细胞可通过与靶细胞之间细胞细胞直接接触达到免疫调节功能;更有学者称MSC细胞的免疫调节作用伴随着细胞凋亡和细胞周期的变化。随MSC细胞应用于治疗自身免疫性疾病或者肿瘤等疾病的研究狂热,更多的人开始关注其临床效果和持续时间。因此本研究的主要目的是观察具有绿色荧光标记GFP的MSC细胞移植至多发性硬化症C57BL/6小鼠模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎后的疗效,并探讨其在细胞因子和细胞水平的免疫调节机制,并追踪有GFP荧光标记的供体MSC细胞在受体C57BL/6小鼠体内的作用部位,数量变化和作用时间,来了解MSC细胞的疗效持久性。材料和方法1.选用20-25g,6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠和GFP-C57BL/6小鼠「北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2012-0001」作为实验对象。30只C57BL/6小鼠进行EAE诱导做为受体小鼠,20只GFP-C57BL/6小鼠作为GFP-MSC细胞的供体小鼠。GFP-MSC细胞移植后小鼠作为MSC治疗组,PBS移植后作为EAE组,未做处理的小鼠作为正常组。2.诱导EAE模型:5mg/ml的CFA与1.5mg/ml的MOG35-55溶液按等体积1:1混合,使用注射器反复推拉成油包水的乳剂,皮下免疫C57BL/6小鼠200ul/只;在MOG免疫第0天和第2天尾静脉注射百日咳毒素(pertussis toxin,PT)2ul/只(稀释于200ul PBS溶液中)。3.获取GFP-MSC细胞:颈椎脱臼处死GFP-C57BL/6小鼠,在无菌条件下剥离其胫骨和股骨,暴露骨髓腔,使用无菌的含有15%FBS的DMEM培养液冲洗出骨髓细胞,放置在37℃35%CO2培养箱中进行培养;培养4h后给细胞换液去除未贴壁细胞,之后的换液频次修改为每12h一次,可根据细胞的铺满率约3天传代一次(使用胰蛋白酶消化贴壁细胞,换液后重新培养);采用光学显微镜技术和流式分析术来鉴定其纯度。4.获取移植后15天EAE组和MSC治疗组小鼠的脊髓组织切片并HE染色:20g/L戊巴比妥钠100ul麻醉小鼠,40g/L多聚甲醛进行心脏灌注,取出其脊髓组织;多聚甲醛固定24h后,送至郑州大学第一附属医院病理科进行组织切片,并HE染色。5.采用ELISA技术检测EAE组,MSC治疗组和正常组小鼠外周血血浆中细胞因子:肿瘤坏死因子α(TNF-α),干扰素γ(IFN-γ),白介素4(IL-4),转化生长因子β(TGF-β)的含量,并进行统计学分析。6.采用流式细胞术检测细胞移植后第2天和第10天受体小鼠脾脏细胞中调节性T细胞(CD4+Foxp3+)的比例;同时检测这两个时间点间充质干细胞移植后小鼠脊髓组织单个核细胞中GFP+细胞的比例。结果1.间充质干细胞培养纯化成功:MSC传代培养至第5代,光学显微镜下观察其形态呈梭形,纺锤形或者多角形等;流式分析结果显示,95%以上的第5代MSC细胞表面抗原为CD34-CD45-CD105+。2.间充质干细胞移植后对EAE小鼠疗效显著:与EAE组小鼠相比,MSC治疗组小鼠在MSC细胞移植后第2天临床评分就明显降低(p<0.05),之后仍旧以缓慢的速度改善小鼠的临床症状;脊髓组织病理分析结果显示,在MSC细胞移植后15天小鼠的有核细胞浸润情况明显改善。3.与正常组小鼠相比,EAE组小鼠外周血血浆中促炎因子TNF-α(21.94±0.46 pg/ml)和IFN-γ(203.8±0.19 pg/ml)的含量显著升高(p<0.05),抗炎因子IL-4(12.87±0.14 pg/ml)和TGF-β(6.74±0.06 pg/ml)的含量显著降低(p<0.05);与EAE组小鼠相比,MSC治疗组小鼠外周血血浆中促炎因子TNF-α(13.82±0.24 pg/ml)和IFN-γ(100.0±0.31 pg/ml)的含量显著降低(p<0.05),抗炎因子IL-4(27.30±0.22 pg/ml)和TGF-β(12.09±0.09 pg/ml)的含量显著升高(p<0.05);甚至,MSC治疗组小鼠IFN-γ的含量低于正常组(141.5±0.21 pg/ml)(p<0.05)。4.流式细胞术分析受体小鼠脾脏细胞中调节性T细胞(Treg)的比例变化:MSC治疗组小鼠脾脏细胞中Treg细胞的比例(19.08±0.33)%显著高于EAE组(6.32±0.19)%和正常组(11.20±0.37)%(p<0.01)。5.流式细胞术分析MSC细胞移植后第2天和第10天受体小鼠脊髓中GFP+MSC细胞的比例:MSC移植后第2天GFP+MSC细胞的比例为(1.82±0.08)%,第10天GFP+MSC细胞基本消失。结论1,MSC对EAE小鼠疗效显著;2,MSC对EAE的治疗缓解作用与其调节细胞因子的分泌和上调Treg细胞有关;3,MSC对EAE的治疗缓解作用会在其消失后一定时间内仍旧存在。