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周围神经损伤修复仍然是临床的研究热点之一。周围神经具有一定的再生能力,神经损伤后相关转录因子的激活与再生相关基因的调控是神经元能存活、轴突再生和功能恢复的关键。在此过程中micro RNA(miRNA)、外泌体等都发挥重要作用。miRNA可以调控基因的表达,miRNA通过靶向目标mRNA分子3’端非翻译区(3’-UTR),抑制mRNA翻译或使其降解,负调控相关基因的表达。多种miRNA对神经损伤后调控再生相关基因密切相关。外泌体(Exo)是天然的纳米级药物载体,可以介导RNA等信号分子在细胞间传递,将遗传物质带入靶细胞,调控其相关基因的表达。目的:构建荷载miRNA-21-5p工程外泌体,并探讨其对DRG神经元作用及机制。为有效操控神经再生相关基因促进周围神经损伤修复提供实验研究基础。方法:(1)分离提取骨髓间充质干细胞(BMSCs)源性外泌体;(2)透射电镜鉴定外泌体;(3)纳米颗粒分析仪(NTA)测定外泌体粒径、浓度、zeta电位;(4)电穿孔法将外源性miR-21-5p/miR-NC加载到外泌体构建工程外泌体(5)Apogee超灵敏纳米流式细胞仪测定miRNA的加载率;(6)体外培养SD大鼠DRG神经元,分别加入iExosomes-21,iExosomes-NC,Exosomes,miR-21-5p+Exosomes(miR-21-5p+Exo),miR-21-5p+转染试剂(Lipofectamine3000;miR-21-5p+LP),及PBS;(7)使用PKH67/Di I标记外泌体或工程外泌体,FAM/CY3标记miRNA-21-5p,使其与离体DRG细胞共培养后观察外泌体及miRNA与神经元和胶质细胞的融合情况;(8)Cell Titer-Glo?检测ATP酶活性,观察各组对离体DRG细胞活力的影响;(9)通过Caspase-Glo?3/7检测凋亡相关蛋白酶Caspase3/7活性,观察miRNA-21-5p对Caspase3/7表达的影响;(10)Hoechst 33342/PI双染检测各组细胞凋亡及坏死情况,观察各组对神经元的保护作用;(11)RT-PCR和Western blot检测miRNA-21-5p靶基因Spry、TIMP3mRNA和蛋白表达水平,验证miRNA-21-5p对相关靶基因调控的影响;(12)通过细胞免疫荧光检测各组对神经突起生长的影响。结果:(1)成功分离提取了BMSCs源性外泌体,通过透射电镜、NTA鉴定其符合外泌体相关特征。(2)用400v,2.5 ms/15 ms电穿孔将miR-21-5p导入外泌体时,15 ms组的加载效率为4.78%,明显高于2.5ms组的1.15%(P<0.01)。(3)BMSCs源性的Exo及miRNA能够被神经元和胶质细胞摄取。(4)各组培养24 h时,与PBS组相比,miR-21-5p+LP组细胞ATP酶活力明显下降(p<0.001),其余各组无明显差异。(5)各组培养72小时,各组间Caspase3/7表达量无明显差异(p>0.05)。(6)各组培养24小时,iexosomes-21组细胞凋亡坏死数明显低于其余各组(p<0.01),且miR-21-5p+LP组与PBS组细胞凋亡坏死数高于其余组(p<0.01)。(7)iexosomes-21有效下调TIMP3 mRNA、Spry2 mRNA及Spry2蛋白水平(p<0.001)。(8)iExosomes-21组与miR-21-5p+LP组神经元突起长度及数目明显优于其余组(p<0.001)。结论:工程外泌体可以将外源性miRNA-21-5p转移到离体DRG细胞,具有保护神经元和促突起生长作用,其机制可能与下调TIMP3和Spry2表达水平相关,但与Caspase3/7表达量无关。工程外泌体可能为神经损伤的治疗促进神经修复提供新的策略。