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目的:课题组前期通过小鼠角膜新生血管模型发现Mxra7基因以及其产物与细胞外基质重建相关,但是关于该基因功能以及机制的研究国内外鲜有报道。为了充分了解Mxra7基因功能以及相关机制,阐明Mxra7基因在病理生理过程中的作用,本课题从寻找MXRA7的互作蛋白出发,并对其功能进行初步研究。从而揭示Mxra7基因参与的信号通路,为相关疾病的治疗提供依据。方法:1.MXRA7互作蛋白的预测与筛选(1)MXRA7互作蛋白的生物信息学预测:首先利用在线分析软件和数据库对MXRA7可能的相互作用蛋白进行生物信息学预测,然后对及其可能的互作蛋白进行分析。(2)酵母双杂交筛选MXRA7互作蛋白采用膜酵母双杂交系统,克隆小鼠Mxra7基因CDS序列,以此蛋白为“诱饵蛋白”,筛选小鼠c DNA文库,寻找MXRA7互作蛋白。挑选具有代表性和潜在重要研究意义的蛋白进行后续验证。2.MXRA7互作蛋白的验证运用基于蛋白质水平的免疫共沉淀和共定位分析等技术对酵母双杂交筛选的结果进行验证。(1)免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)将p CDNA3.1-HA-MUP1质粒转染Hepa1-6细胞(前期已经稳转MXRA7质粒),通过protein A/G-beads+Anti-HA和protein A/G-beads+Anti-MXRA7(平行实验)分别进行免疫复合物共沉淀,再以抗MXRA7和抗HA的抗体行Western blot检测,.确定外源性的MXRA7和MUP1在细胞内是否存在相互作用。(2)共定位分析构建带有HA标签的MUP1质粒转染Hepa1-6细胞(前期已经稳转MXRA7质粒),转染48h后,利用不同种属来源的抗体进行免疫荧光双标记,在荧光共聚焦显微镜下观察外源性的MXRA7和MUP1在细胞体内是否存在共定位现象。(3)His pull-down分析利用原核诱导表达的His-MUP1与MXRA7蛋白,进行体外His pull-down实验,经SDS-PAGE分析,用抗MUP1的抗体进行检测,分析MXRA7和MUP1在体外是否存在互作。3.MXRA7在血糖调节中的作用构建Mxra7基因敲除鼠(其对照为野生鼠),同时基于高压水流动力学原理利用尾静脉注射MXRA7微环质粒构建Mxra7基因过表达鼠(对照组为尾静脉注射空载微环质粒的小鼠),比较MXRA7敲除以及过表达情况下的小鼠与各自对照组血糖值的变化,以此推测MXRA7在血糖调节中的作用。结果:1.MXRA7互作蛋白的预测与筛选在本研究中,我们用MXRA7蛋白作为诱饵通过酵母双杂交系统筛选到了HDLBP、ALDH1L1、MUP1、GLUD1、MUP2、CYTB、TRF、CPT1A、APOA2、RDH7、ALB、MAT1A、SERPINA1A、MUP16、GNMT等33个候选蛋白。可以看出它们主要均是参与肝脏糖、脂代谢相关的蛋白。其中以MUP1蛋白在所有候选者分析中得分最高,最有可能是MXRA7的互作蛋白,故本部分现以MUP1为代表进行后续验证。2.MXRA7互作蛋白的验证为验证MXRA7与MUP1的互作。实验用小鼠肝脏为研究对象,提取肝脏蛋白进行Co-IP实验,结果显示MXRA7蛋白可以特异性结合MUP1蛋白,此结果可以初步证明MXRA7蛋白与MUP1蛋白在小鼠肝脏的自然生理条件下存在相互作用。我们利用原核诱导表达的两个纯蛋白MXRA7与His-MUP1进行His pull-down实验,发现MXRA7能够与MUP1蛋白特异性结合,并且可以初步断定两者的相互作用是直接的,不需要中间其他蛋白为桥梁。为研究MXRA7与MUP1的在哺乳动物细胞的相互作用,本实验室将p CDNA3.1-HA-MUP1质粒转入Hepa1-6细胞(前期稳转MXRA7质粒),利用免疫共沉淀的方法同样检测到MXRA7与MUP1的互作现象。说明MXRA7与MUP1在Hepa1-6细胞内是可以互作的;并对MXRA7与MUP1在细胞内位置进行分析,发现MXRA7与MUP1在Hepa1-6细胞胞浆内有共定位现象。3.MXRA7在血糖调节中的作用通过检测Mxra7敲除鼠(对照组为野生鼠)以及尾静脉注射MXRA7微环质粒方法构建的Mxra7过表达鼠(对照组为尾静脉注射空载微环质粒的小鼠)的血糖变化,发现Mxra7基因可以帮助小鼠稳定血糖,Mxra7基因的缺失或不足容易引起小鼠血糖升高。MXRA7在血糖调节中起到了非常重要的作用,其原因可能是通过与MUP1发生相互作用,对血糖水平进行调节,但此假设仍需进一步验证。结论:MXRA7蛋白与MUP1的蛋白在体内体外均可以产生特异性互作,并且MXRA7在血糖调节中起到了非常重要的作用。目的:原核诱导表达ATP5B表位串连子肽段,将其免疫新西兰大白兔获得ATP5B肽段特异性多克隆抗体,用于细胞膜表面异位ATP5B蛋白功能的后续研究。方法:根据ATP5B 3D结构分析预测其位于分子表面的表位序列,并设计为串连子肽段,合成其DNA序列并克隆入p ET24a质粒,将p ET24a-ATP5B质粒转入大肠杆菌,筛选阳性克隆菌株,使用IPTG诱导ATP5B肽段的表达。将纯化脱盐后ATP5B肽段免疫新西兰大白兔,制备抗ATP5B兔多克隆抗体。饱和硫酸铵法粗纯ATP5B抗体,ELISA方法检测其效价,采用Western blot、流式、免疫荧光等方法验证其适用范围。结果:用Ni-NTA亲和层析和割胶回收法制备了较纯的ATP5B肽段;成功获得抗ATP5B多克隆抗体,效价为1:270000;且此抗体适用于Western blot、流式细胞术及免疫荧光等检测方法。结论:制备了纯度较高的ATP5B肽段,并用此肽段对兔子进行免疫,获得了效价较高的抗体,并通过一系列方法验证了该抗体的特异性及应用性。为后续应用重组多肽和抗体进行相关功能研究提供了有利工具。