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第一部分miR-29b、miR-29c、B7H3在哮喘患儿外周血中的表达及临床意义目的:研究哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)中miR-29b、miR-29c、B7 H3mRNA(信使RNA)的表达,探讨其在哮喘中异常表达的临床意义。方法:选取2018年5月-2019年4月在苏州大学附属儿童医院门诊就诊并符合哮喘诊断的患儿48例作为哮喘组,其中急性发作期患儿25例,非急性发作期23例,选取同期行外科择期手术的患儿15例作为对照,采取外周血并分离PBM C,提取RNA并进行逆转录,采用实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)技术测定miR-29b、miR-29c、B7H3mRNA的表达并收集患儿的哮喘家族史、变应性疾病史等。结果:1.哮喘急性发作期组患儿的变应性疾病发生率(68%)高于其他两组(34.8%、33.3%),P=0.032,正常组的哮喘家族史(0%)远低于其他两组(52%、60.9%),P=0.001,P<0.05,差别具有统计学意义;2.哮喘急性发作期组PBMC中B7H3表达量高于哮喘非急性发作期组与正常组(表达量分别为:0.59±0.10、0.35±0.07、0.13±0.25),P<0.0001,差异有统计学意义;3.正常组 PBMC 中 miR-29b表达量明显高于哮喘患儿非急性发作期组与急性发作期组(表达量分别为:1.01±0.26、0.43±0.21、0.20±0.18),P<0.0001,哮喘非急性发作期组 miR-29b 表达量高于哮喘急性发作期组,P=0.007,差异有统计学意义。结论:正常儿童PBMC中miR-29b、miR-29c表达高于哮喘儿童、B7H3mR NA的表达低于哮喘儿童,初步猜想miR-29b、miR-29c对于哮喘儿童具有保护作用,而B7H3加重炎症反应。第二部分miR-29c调控巨噬细胞B7H3表达促进CD4+T细胞分化及作用机制目的:探讨miR-29c调控巨噬细胞B7H3的表达影响CD4+T细胞的分化的机制。方法:1.THP-1细胞用PMA(佛波酯)试剂诱导分化为单核巨噬细胞。2.调节相关基因(miR-29c、B7H3)表达后的巨噬细胞与CD4+T细胞共培养3天,收集CD4+T细胞进行T-bet(T盒转录因子21)、GATA3(GATA结合蛋白3)、R OR-γt(孤儿核受体)mRNA水平的检测,收集上清应用酶联免疫吸附方法(E1 isa)进行IFN-γ、IL-4、IL-17 的检测。2.分组:a)THP-1+EV(miRNA):miR NA空载慢病毒侵染THP-1细胞,诱导分化成巨噬细胞后与CD4+T细胞共培养;b)THP-1+miR-29c:过表达miR-29c慢病毒侵染THP-1细胞,诱导分化成巨噬细胞后与CD4+T细胞共培养;c)THP-1+sh-miR-29c:沉默miR-29c慢病毒侵染THP-1细胞,诱导分化成巨噬细胞后与CD4+T细胞共培养;d)THP-1+EV(miR NA)+EV(mRNA):miRNA空载慢病毒与mRNA空载慢病毒共侵染THP-1细胞,诱导分化成巨噬细胞后与CD4+T细胞共培养;e)THP-1+miR-29c+B7H3:过表达miR-29c慢病毒与过表达B7H3慢病毒共侵染THP-1细胞,诱导分化成巨噬细胞后与 CD4+T 细胞共培养;f)THP-1+sh-miR-29c+sh-B7H3:沉默 miR-29c 慢病毒与下调B7H3慢病毒共侵染THP-1细胞,诱导分化成巨噬细胞后与CD4+T细胞共培养。结果:1.THP-1+EV(miRNA)组与 THP-1+EV(miRNA)+EV(mRNA)组比较得知miR-29c、B7H3表达正常的巨噬细胞对Th0细胞的分化基本无影响;THP-1+EV(miRNA)组与 THP-1+miR-29c 组、THP-1+sh-miR-29c 组比较可知过表达miR-29c的巨噬细胞可促进CD4+T细胞表达T-bet、ROR-γt,抑制GATA3的表达,促进 Th0 细胞向 Th1、Th17 细胞分化;THP-1+miR-29c 组与 THP-1+miR-29c+B7 H3 组比较及 THP-1+sh-miR-29c 与 THP-1+sh-miR-29c+sh-B7H3 比较可知巨噬细胞过表达B7H3可抑制CD4+T细胞表达T-bet、ROR-γt,促进GATA3的表达,促进 Th0 细胞向 Th2 细胞分化。THP-1+sh-miR-29c 与 THP-1+sh-miR-29c+sh-B7H3比较可知,巨噬细胞促进Th0细胞向Th2细胞分化可通过巨噬细胞低表达miR-29c从而使巨噬细胞B7H3mRNA增多实现。2.THP-1+EV(miRNA)组与THP-1+miR-29c组、THP-1+sh-miR-29c组比较可知巨噬细胞过表达miR-29c可促进IF N-γ、IL-17 分泌,抑制 IL-4 的分泌;THP-1+miR-29c 组与 THP-1+miR-29c+B7 H3 组比较及 THP-1+sh-miR-29c 与 THP-1+sh-miR-29c+sh-B7H3 组比较可知巨噬细胞过表达B7H3可抑制IFN-γ、IL-17分泌,促进IL-4分泌。THP-1+sh-miR-29 c与THP-1+sh-miR-29c+sh-B7H3比较可知,巨噬细胞促进T细胞分泌IL-4可通过巨噬细胞低表达miR-29c从而使巨噬细胞B7H3mRNA增多实现。结论:下调miR-29c的巨噬细胞,可以通过增加B7H3mRNA的表达,促进Th0细胞向Th2型细胞分化。第三部分下调miR-29b的巨噬细胞对于Th0细胞极化的影响目的:探讨miR-29b对巨噬细胞功能的影响以及调节巨噬细胞B7H3、STAT 3表达促进Th0细胞极化的机制。方法:1.接种THP-1细胞,加终浓度为50ng/ml的PMA培养6h后,换无P MA完全培养基继续培养24h,然后用LV526、LV527和NC病毒侵染诱导成功的巨噬细胞,24h收集样品进行qPCR检测,分析miR-29b上、下调对巨噬细胞功能的影响。2.用LV526、LV527和NC病毒侵染诱导成功的巨噬细胞形成miR-29b干扰、miR-29b过表达以及正常对照组,培养24h后收集细胞检测STAT3和B7H3 mRNA表达变化,WB检测STAT3和B7H3蛋白表达变化。3.验证ST AT3为miR-29b的靶基因:接种THP-1细胞,加终浓度为50ng/ml的PMA培养6h后,换无PMA完全培养基继续培养24h,然后用LV528、LV529和NC病毒侵染诱导成功的巨噬细胞形成miR-29b干扰、miR-29b过表达以及正常对照组,48h进行荧光素酶分析来验证STAT3为miR-29b的靶基因。构建STAT3-3’-UT R荧光素酶报告基因质粒,并分为3组“miR-29b+STAT3-3’-UTR”、“miR-29b+STAT3-mut-3’-UTR”、“miR-29b+荧光素酶空载”。4.不同处理方式的巨噬细胞与初始T细胞共培养3天,qpcr检测T-bet、GATA3、ROR-yt的相对表达量。结果:1.沉默表达 miR-29b后IL-4Rα、IL-4、IL-5、IL-13、CD206 明显升高,而IFN-γ下降,提示miR-29b可以促进巨噬细胞向M2极化。2.巨噬细胞过表达miR-29b,STAT3、B7H3基因水平及蛋白水平表达下降;抑制miR-29b,STAT3、B7H3基因水平及蛋白水平表达上升。2.巨噬细胞STAT3与B7H3mRN A的表达成显著正相关(r=0.9737,P<0.0001)。3.STAT3是miR-29b的靶基因。4.巨噬细胞与初始T细胞共培养,可促进初始T细胞即Th0细胞向Th2方向分化,其中下调miR-29b的巨噬细胞促进作用更明显。结论:在巨噬细胞中下调miR-29b,可促进巨噬细胞向M2极化。在巨噬细胞中下调miR-29b,可使靶基因B7H3及STAT3表达增加,使Th0细胞向Th2细胞分化。