DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，DNA的异常甲基化往往是导致癌症发生的重要原因。近年来，DNA甲基化与肿瘤的发生发展及预后的相关研究成为当今的研究热点。DNA甲基化的检测方法是DNA甲基化研究的基础。目前存在的DNA甲基化检测方法存在这样那样的缺陷，无法满足对于各种DNA甲基化研究的需要，因此建立新的DNA甲基化检测方法对于DNA甲基化的研究具有重要的意义。本研究是基于亚硫酸盐测序方法提出的，芯片高通量固定技术与滚环技术相结合，高通量进行分子克隆，然后通过芯片杂交技术来检测每一个DNA片断的甲基化谱。胃癌在我国的发病率居各种恶性肿瘤的首位，因此采用以上平台，我们进行多个胃癌样本的检测，以找出p16基因甲基化谱与胃癌发生的关系。该方法一旦研究成功，将对甲基化的检测具有重要的推动意义。具体内容如下： 1.COLONY方法：单个肿瘤细胞甲基谱的检测对于了解肿瘤发生发展的机制具有重要的意义。在该研究中我们研究了一种方法，可以用来分析一组肿瘤细胞单个DNA片断的甲基化谱，该方法是基于分子克隆微阵列芯片技术的一种新方法。该方法为：将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA做为模板进行PCR扩增，并采用双引物超支滚环扩增(two-primer hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)将每一个PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶内进行克隆并形成单克隆微阵列芯片。由于肿瘤细胞的每一个细胞的甲基化谱都不太一样，所以PCR扩增产物是具有不同的核酸序的一个PCR产物库。在该方法中，我们将超支滚环扩所使用的一条引物的5’端修饰上一个丙烯酰胺基团，采用这个修饰基团将这条引物固定在聚丙烯酰胺胶内。由于聚丙烯酰胺胶以及固定的一条引物阻止了超支滚环扩增产物的移动，不同模板扩增产物都聚集在原来扩增的位置，形成一个个分子单克隆。采用变性电泳的方法移去没有固定下来的另一条链，并与多对特异探针杂交，检测p16基因不同CpG位点的甲基化。采用该方法我们成功地检测了三例胃癌p16基因的甲基化，因此该方法为高通量检测单个细胞的某一基因的甲基化谱提供了有意义的检测工具。 2.由于COLONY方法在扩增过程中条件较难控制，我们又发展了采用磁珠和胶固定方法制备分子克隆的方法，其方法为：我们将超支滚环扩增的一条引物固定在磁珠上，然后将待克隆检测环形模板与固定后的引物复性，保证每个磁珠上最多只有一个环状模板。然后将固定有引物和克隆模板的磁珠由聚丙烯酰胺胶固定在玻片上，然后进行固相超支滚环扩增，制备出高通量检测克隆芯片，进一步通过杂交检测胃癌p16基因的甲基化谱。 3.BEAMing超支滚环扩增克隆法：该方法是在传统的BEAMing(beads，emulsion，amplification，and magnetic)技术与本文第二种方法的基础上发展起来的一种方法，该方法为：我们在乳液中进行超支滚环扩增，而不是固定在胶中扩增。每个乳液液滴中只含有最多一个磁珠和一个待克隆模板，克隆模板的扩增方法为超支滚环扩增，采用该平台我们成功检测了10例胃癌样本及相应的正常组p16基因启动子区域的甲基化谱，我们的实验结果证明这种方法还能够高灵敏度地定量检测甲基化水平。